多核苷酸改组方法技术

本发明专利技术的第一个目的是提供一种制备Tile载体的方法，所述Tile载体是包含选择性标记和编码多核苷酸的载体，其中所述编码多核苷酸的前面和后面紧接着Ms型识别序列,其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向。更具体地，所述前面的和后面的IIs型识别序列的位置和方向提供了所述Tile载体被相应的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各个末端处含有具有已知的方向和长度的突出端序列同时缺少所述前面的和后面的Ms型识别序列的所述编码多核苷酸序列的释放。本发明专利技术的第二个目的是提供使用如前面所述获得的Tile载体连接两个或更多个编码多核苷酸以形成产物多核苷酸的方法。典型地，所述产物多核苷酸整合在载体中。

Polynucleotide reorganization method

The first object of the invention is to provide a method for preparing a tile carrier, which comprises a carrier for selectively labeling and encoding polynucleotides, wherein the front and back of the encoding polynucleotides are immediately followed by an MS type recognition sequence, wherein the front and back recognition sequences are recognized by the same IIS type restriction endonuclease, but in the opposite direction. More specifically, the position and direction of the front and back type IIs recognition sequences provide that the tile vector is cleaved by the corresponding type IIs restriction endonuclease, resulting in the release of the encoded polynucleotide sequence with a known direction and length of the protruding end sequence at each end and the absence of the front and back type MS recognition sequences. A second object of the invention is to provide a method for connecting two or more encoded polynucleotides to form a product polynucleotide using a tile carrier obtained as described above. Typically, the product polynucleotide is integrated in the carrier.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多核苷酸改组方法
技术介绍
A.
蛋白质是高度通用的生物分子，其执行宽范围的功能，所述功能的范围从天然催化作用(酶)、表位识别(抗体)到结构性功能。酶以高速率执行非常特异性反应的能力使得它们越来越可用于各种领域，包括技术用途(造纸和纺织工业)、食品和饲料工业(奶制品、烘焙、酿造、果汁生产、淀粉加工)、有机合成工业、化妆品、医学和生物技术。就此而言，工业酶已经彻底改变了我们的日常生活。抗体结合特异性表位并且被开发成为诊断工具和治疗药物。结构性蛋白质在细胞或组织的结构中具有重要的功能。最熟知的实例是胶原蛋白，其丰富地存在于我们的骨骼和皮肤中。自然界已经配置了蛋白质来执行其天然功能，这些天然功能通过达尔文进化来优化。然而，在蛋白质的天然功能与科学家和工程师所设想的应用之间大多数情况下存在着极大的矛盾。因此，天然蛋白质不得不被改造以引入新的或所需要的性质以用于各种各样的应用(Lutz,2010)。用于蛋白质工程的稳健的和通用的技术因此在促进蛋白质用于市场的可能性方面具有至关重要的地位。B.相关技术的描述蛋白质工程领域在过去二十年中已经经历了极大的技术转变。实际上，体外蛋白质工程在实验室规模上模拟天然蛋白质进化动力。垂直进化或适应进化暗示在蛋白质编码序列中基因突变的积累，产生了具有改变的性质的蛋白质。此过程可以在体外通过定点诱变来进行以修饰所选择的氨基酸提高催化性质(例如，反应速率)或生物物理性质(例如，稳定性)(合理设计)。然而，定点诱变仅当三维结构和/或酶机制已知时才有意义，并且此信息经常是不可获得的。随着开发用于随机诱变的技术用于定向进化，此要求被避开了。有趣的是，证明随机诱变与定点诱变是互补的，因为经常选择到在离催化性氨基酸更远的位点处的非预期氨基酸中的突变体。蛋白质进化新功能的另一主要机制受遗传片段交换(改组/水平转移)驱动(Lutz和Benkovic,2000)。这样，形成了具有新功能的完全改变的蛋白质。利用体外蛋白质工程仅可以将这种进化动力模拟到有限的程度。通过限制性内切/连接进行的结构域互换允许使用传统的分子克隆技术以合理的方式将来自不同来源的蛋白质编码片段进行重组。要求是缺少在此克隆过程中所使用的限制性位点的识别位点。当来自不同来源的多个片段被随机组装并且需要许多种不同的限制性内切酶时，此要求变得特别繁琐。DNA改组是一种允许亲代序列的随机改组的方法，但该方法仅适用于密切相关的基因(>70％序列同一性，家族改组)。然而，具有低序列同一性的不相关基因的片段的无限制性改组具有以最破坏性的方式设计新蛋白质功能的可能性。技术上的难题已经阻碍了此领域中的进展。由于缺少基因片段之间的同源性，传统的重组是不可能的。已经报道采用两种方法(SHIPREC和ITCHY)来从关系遥远的序列形成杂合蛋白质(Ostermeier等人，1999；Sieber等人,2001；Patrick和Gerth,2014)。然而，两种方法限于由来源于两个亲代基因的两个片段的杂合体。SCRATCHY是基于ITCHY的更复杂的方法，并且SCOPE允许多个片段的重组，但那些片段仍然仅来源于两个亲代基因(Kawarasaki等人，2003；O’Maille等人,2002)。GoldenGate改组是一种允许以合理方式和随机方式两种方式改组来自亲代基因的片段的方法。不同亲代基因的片段之间的接头是在每个接头处所有亲代基因中存在的四个保守核苷酸。为了鉴定潜在的接头位点，需要这些基因之间具有足够高的同源性。GoldenGate改组依赖IIs型限制性内切酶的独特特性，即，在识别位点外的裂解。这允许在识别位点位于片段的末端处时移除该识别位点。这种特性允许在一个试管中同时进行限制性内切/连接，用于无疤痕组装体中的多个基因片段的组装的一步反应(Engler等人,2009)。不受限制地，将来自许多不同来源的大量不相关基因片段大规模改组以形成新型酶仍然是蛋白质工程领域中的空白。类似于随机诱变，预期不相关片段的随机改组将一般产生许多意想不到的新型的改良的嵌合蛋白质，所述嵌合蛋白质组合了以前不能合理想到的片段。本专利技术提供了用于制备在用于生成产物多核苷酸的方法中使用的载体(称为Tile载体，其特别适合用作编码蛋白质单元的多核苷酸的储备和/或供体载体)的有效方法，其中所述产物多核苷酸包含两个或更多个所述编码蛋白质单元的多核苷酸的组合。优选地，所述编码蛋白质单元的多核苷酸在所述产物多核苷酸内组合使得它们的序列整合在单一阅读框内。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种制备Tile载体的方法，所述Tile载体是包含选择性标记和编码多核苷酸的载体，其中所述编码多核苷酸的前面和后面紧接着IIs型识别序列,其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向。更具体地，所述前面的和后面的IIs型识别序列的位置和方向提供了所述Tile载体被相应的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各个末端含有具有已知的方向和长度的突出端序列同时缺少所述前面的和后面的IIs型识别序列的所述编码多核苷酸序列的释放。本专利技术的第二个目的是提供使用如前面所述获得的Tile载体连接两个或更多个编码多核苷酸以形成产物多核苷酸的方法。典型地，所述产物多核苷酸整合在载体中。从下面给出的详述中本专利技术的应用性的更多范围将显而易见。然而，应该理解的是，详述和具体实施例，在显示本专利技术的优选实施方案的同时，仅通过说明的方式给出，因为从此详述中在本专利技术的精神和范围内的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。要理解的是，前面的一般描述和下面的详述两者都仅是示例性的和解释性的，不是对如权利要求所保护的本专利技术的限制。本专利技术可以进一步总结为下面的叙述。1.一种制备Tile载体(24)的方法，所述Tile载体(24)包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着IIs型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10),其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，其中所述Tile载体(24)可以使用识别所述前面的和后面的识别位点的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各末端具有已知的突出端序列的所述编码多核苷酸序列(10)的释放，所述释放的编码多核苷酸序列缺少所述前面的和后面的IIs型识别序列；所述方法包括下列步骤：a)提供初始编码多核苷酸(8)并用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸所述多核苷酸的各个末端，其中所述末端序列中每一个包含下列元件：i.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)邻接所述初始编码多核苷酸的各个末端并在所述初始编码多核苷酸的开放阅读框的框内加入；ii.邻接所述编码延伸序列的第一IIs型识别序列(12)，其中所述第一识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的IIs型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列(11)内裂解从而产生突出端，并且其中所述第一末端序列和第二末端序列的所述第一IIs型识别序列(12)被相同的IIs型酶识别，但具有相反的方向；...

【技术保护点】
1.一种制备Tile载体(24)的方法，所述Tile载体(24)包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着IIs型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10),其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，/n其中所述Tile载体能够使用识别所述前面的和后面的识别位点的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各末端具有已知的突出端序列的所述编码多核苷酸序列的释放，所述释放的编码多核苷酸序列缺少所述前面的和后面的IIs型识别序列；/n所述方法包括下列步骤：/na)提供初始编码多核苷酸(8)并用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸所述多核苷酸的各个末端，其中所述末端序列中每一个包含下列元件：/ni.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)邻接所述初始编码多核苷酸的各个末端并在所述初始编码多核苷酸的开放阅读框的框内加入；/nii.邻接所述编码延伸序列的第一IIs型识别序列(12)，其中所述第一识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的IIs型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列内裂解从而产生突出端，并且其中所述第一末端序列和第二末端序列的所述第一IIs型识别序列被相同的IIs型酶识别，但具有相反的方向；/niii.邻接所述第一IIs型识别序列或在所述第一IIs型识别序列内的间隔区序列(13)；/niv.邻接所述间隔区序列的第二IIs型识别序列(14)，其中所述第二识别序列被定向成使得识别所述第二识别序列的IIs型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列从而产生间隔区突出端，并且其中所述第二IIs型识别序列不被识别所述第一IIs型识别序列的IIs型酶识别；/nv.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许IIs型限制性内切酶与所述第二识别序列结合；/nb)提供接收载体(1)，所述接收载体(1)包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含定位于第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)之间的选择性标记(6)，使得所述载体能够使用识别所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)的IIs型识别酶裂解，从而形成：/n■填充序列(2)，所述填充序列(2)包含所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)；和/n■选择性载体片段(7)，所述选择性载体片段(7)包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一IIs型识别序列和第二IIs型识别序列并且具有非互补的末端突出端，其中一个突出端与在使用识别所述第一末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型识别酶裂解所述第一末端序列后获得的间隔区突出端互补，而另一突出端序列与通过使用识别所述第二末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶裂解所述第二末端序列获得的间隔区突出端互补；/nc)孵育混合物，其中所述混合物包含：/ni.步骤(a)的延伸的初始编码多核苷酸；/nii.步骤(b)的接收载体；/niii.识别所述延伸的初始编码多核苷酸的末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶；/niv.识别所述接收载体的所述第一IIs型识别序列和第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶；/nv.DNA连接酶。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161219 GB 1621589.91.一种制备Tile载体(24)的方法，所述Tile载体(24)包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着IIs型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10),其中所述前面的和后面的识别序列被相同的IIs型限制性内切酶识别，但具有相反的方向，
其中所述Tile载体能够使用识别所述前面的和后面的识别位点的IIs型限制性内切酶裂解，导致在其各末端具有已知的突出端序列的所述编码多核苷酸序列的释放，所述释放的编码多核苷酸序列缺少所述前面的和后面的IIs型识别序列；
所述方法包括下列步骤：
a)提供初始编码多核苷酸(8)并用第一末端序列(16)和第二末端序列(17)延伸所述多核苷酸的各个末端，其中所述末端序列中每一个包含下列元件：
i.编码延伸序列(11)(3xn),所述编码延伸序列(11)(3xn)邻接所述初始编码多核苷酸的各个末端并在所述初始编码多核苷酸的开放阅读框的框内加入；
ii.邻接所述编码延伸序列的第一IIs型识别序列(12)，其中所述第一识别序列被定向成使得识别所述第一识别位点的IIs型限制性内切酶能够在所述编码延伸序列内裂解从而产生突出端，并且其中所述第一末端序列和第二末端序列的所述第一IIs型识别序列被相同的IIs型酶识别，但具有相反的方向；
iii.邻接所述第一IIs型识别序列或在所述第一IIs型识别序列内的间隔区序列(13)；
iv.邻接所述间隔区序列的第二IIs型识别序列(14)，其中所述第二识别序列被定向成使得识别所述第二识别序列的IIs型限制性内切酶能够裂解所述间隔区序列从而产生间隔区突出端，并且其中所述第二IIs型识别序列不被识别所述第一IIs型识别序列的IIs型酶识别；
v.尾序列(15)，所述尾序列(15)具有足够的长度以便允许IIs型限制性内切酶与所述第二识别序列结合；
b)提供接收载体(1)，所述接收载体(1)包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含定位于第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)之间的选择性标记(6)，使得所述载体能够使用识别所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)的IIs型识别酶裂解，从而形成：
■填充序列(2)，所述填充序列(2)包含所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)；和
■选择性载体片段(7)，所述选择性载体片段(7)包含所述选择性标记(6)但缺少所述第一IIs型识别序列和第二IIs型识别序列并且具有非互补的末端突出端，其中一个突出端与在使用识别所述第一末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型识别酶裂解所述第一末端序列后获得的间隔区突出端互补，而另一突出端序列与通过使用识别所述第二末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶裂解所述第二末端序列获得的间隔区突出端互补；
c)孵育混合物，其中所述混合物包含：
i.步骤(a)的延伸的初始编码多核苷酸；
ii.步骤(b)的接收载体；
iii.识别所述延伸的初始编码多核苷酸的末端序列的所述第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶；
iv.识别所述接收载体的所述第一IIs型识别序列和第二IIs型识别序列的IIs型限制性内切酶；
v.DNA连接酶。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接收载体的所述填充片段(2)包含反向选择性标记(5)。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中延伸的多核苷酸的第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的所述第二IIs型识别序列(14)被相同的IIs型酶识别。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述接收载体的所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)被相同的IIs型酶识别，但具有相反的方向。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述接收载体的所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)与所述延伸的初始编码多核苷酸的所述第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的第二IIs型识别序列(14)一样被相同的IIs型酶识别。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述接收载体(1)包含两个多克隆位点,第一个多克隆位点包含一系列多个不同的IIs型识别序列，并且第二个多克隆位点包含与所述第一个多克隆位点中的那些一样被相同的IIs型酶识别的方向相反的IIs型识别序列，其中所述多克隆位点包含所述接收载体(1)的所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)，所述接收载体(1)的所述第一IIs型识别序列(3)和第二IIs型识别序列(4)与所述延伸的初始编码多核苷酸的所述第一末端序列(16)和第二末端序列(17)的第二IIs型识别序列(14)一样被相同的IIs型酶识别。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中用所述末端序列(16,17)延伸的所述初始编码多核苷酸(8)使用DNA合成法制备。


8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述初始编码多核苷酸(8)利用所述末端序列(16,17)使用聚合酶链式反应(PCR)延伸，其中所述PCR涉及使用在所述初始编码多核苷酸的各个末端上退火的加尾的正向引物和反向引物，其中所述正向引物的尾部添加所述第一末端序列(16)，所述反向引物的尾部添加所述第二末端序列(17)。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述PCR是易错PCR，由此生成大量载体，所述载体由于包含所述初始编码多核苷酸的随机突变体而彼此不同。


10.根据权利要求8所述的方法，其中所述PCR涉及定点诱变PCR，允许在所述初始编码序列内引入预定的突变。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法包括在包含在所述Tile载体中的所述初始编码多核苷酸的序列内引入定向突变的附加步骤，所述附加步骤包括使用Kunkel法、利用错配引物的PCR定向诱变或全质粒诱变法(例如Quickchange法)。


12.一种Tile载体(24)，包含选择性标记(6)以及前面和后面紧接着IIs型识别序列(12)的编码多核苷酸序列(10)，
其中所述前面的和后面的IIs型识别序列(12)被相同的IIs型限制性内切酶识别但具有相反的方向；
所述Tile载体(24)的特征在于所述编码多核苷酸序列(...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·格里蒙，H·格斯特曼，Y·布赖斯，R·拉威尼，
申请(专利权)人：根特大学，勒芬天主教大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE