人源化类脑器官缺血模型制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种人源化类脑器官缺血模型及其制备方法、应用，所述制备方法为：将类脑器官加入无糖DMEM培养基中，培养基中DMSO浓度≤1‰，然后放置于三气培养箱(1％O2、5％CO2、94％N2)中培养。其优点表现在：本发明专利技术提供了一种新的脑缺血模型，为脑缺血研究提供了新的模型构建方向，为脑缺血药物筛选提供了新的可选择筛选模型。本发明专利技术首次开展了类脑在脑缺血模型构建以及药物筛选中的应用研究。

Preparation and application of human brain like organ ischemia model

The invention relates to a human brain like organ ischemia model and a preparation method and application thereof. The preparation method is: adding brain like organs into a sugar free DMEM medium, the DMSO concentration in the medium is less than or equal to 1 \u2030, and then culturing in a three gas incubator (1% O2, 5% CO2, 94% N2). The invention has the advantages that: the invention provides a new cerebral ischemia model, provides a new model construction direction for cerebral ischemia research, and provides a new optional screening model for cerebral ischemia drug screening. The invention first carries out the application research of brain like in the construction of cerebral ischemia model and drug screening.

【技术实现步骤摘要】
人源化类脑器官缺血模型制备及应用
本专利技术涉及脑科学
，具体地说，是人源化类脑器官缺血模型及其制备方法、应用。
技术介绍
近几年，针对多能干细胞(pluripotentstemcell)的研究逐渐增多。在体外培养环境下，给予多能干细胞特定的培养条件，可使其朝向不同的方向发展，如外胚层、中胚层、内胚层，进而分化成不同类型的细胞、器官样组织，包括脑组织。2013年，奥地利科学家在Nature杂志上报道称，首次通过3D培养系统，将多能干细胞诱导培育为类脑器官。这种类脑器官被称为“cerebralorganoids”，它可以成功模拟脑皮层发展进程，结合RNA干扰技术和病人来源的诱导性多能干细胞，首次成功构建头小畸形疾病模型。随后，2016年5月，Cell杂志上的一篇最新文献，来自美国约翰霍普金斯大学的团队通过旋转生物发生器培养的方法，优化了类脑器官的诱导培育方法，降低培育成本，提高可操作重复性，并实现类脑器官的脑区域特定分化，分别得到了类前脑、中脑和下丘脑样器官。随着研究的逐渐推进，类脑器官及脑区特异性类脑的应用正在逐步推广，例如，类脑可模拟寨卡病毒引起的头小畸形症；探究产前酒精暴露对类脑的神经突生长、神经再生的影响；利用阿尔茨海默病患者来源的诱导性多能干细胞结合presenilin-1突变，模拟脑皮层神经退化微环境；利用类脑芯片模拟尼古丁暴露等。但是，目前尚无文献报道类脑在脑缺血模型构建及药物筛选中的应用。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种类脑器官缺血模型的制备方法。本专利技术的第二个目的是，提供一种类脑器官缺血模型。本专利技术的第三个目的是，提供一种类脑器官缺血模型的应用。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种类脑器官缺血模型的制备方法，所述制备方法为：将类脑器官加入无糖DMEM培养基中，所述培养基中DMSO浓度≤1‰，然后放置于培养箱中培养。所述类脑器官为人源化类脑器官。所述人源化类脑器官为3D结构的人源化类脑器官。所述人源化类脑器官由人多能干细胞先后经历胚层分化、神经外胚层分化、神经上皮组织形成，并在旋转发生瓶中诱导得到3D结构的人源化类脑器官。所述人源化类脑器官的制备方法包括以下步骤：(1)超低吸附孔板内接种人多能干细胞，获得胚胎小体样细胞簇；(2)继续诱导分化，胚胎小体样细胞簇开始出现胚层分化特征，形成初始的神经上皮样组织，并转移至新的超低吸附孔板内继续培养；(3)神经上皮样组织继续诱导分化，经历Matrigel胶滴包被的静态培养，形成神经上皮芽样组织，即开始进行类脑器官的分化；(4)将包被Matrigel胶滴的神经上皮芽样组织转移至旋转发生瓶内，继续培养，获得形成脑功能分区、表达前脑标记物和脉络丛标记物的类脑器官。所述培养箱为三气培养箱。所述三气培养箱中含1％O2、5％CO2、94％N2。所述类脑器官加入无糖DMEM培养基之前，先吸弃细胞培养基，再用PBS清洗。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：上述制备方法制备的类脑器官缺血模型。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：所述的类脑器官缺血模型在药物筛选中的应用。本专利技术优点在于：1、本专利技术提供了一种新的脑缺血模型，随着缺糖缺氧(OGD)时间的延长，其Caspase3activity增加、LDHRelease增加；给予脑缺血通路有关的自噬抑制剂3-MA、Caspase3凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、nNOS抑制剂L-NAME、AMPA抑制剂CNQX均可显著降低OGD引起的Caspase3activity增加，即有效减少细胞死亡。2、本专利技术为脑缺血研究提供了新的模型构建方向，为脑缺血药物筛选提供了新的可选择筛选模型。3、本专利技术首次开展了类脑在脑缺血模型构建以及药物筛选中的应用研究。附图说明附图1是类脑器官不同培养阶段的示意图(倒置显微镜下拍摄)。附图2是不同发育时间的类脑器官免疫荧光图(激光共聚焦显微镜下拍摄)。在类脑器官培育的不同阶段，取培养15天、30天、60天的类脑进行冰冻切片及免疫荧光染色。通过标记神经干细胞标记物SOX2和神经元标记物Tuj-1，显示随着培育时间的延长，干细胞比例减少，神经元比例增加，即类脑器官逐渐发育成熟。附图3是类脑器官形成“前脑和脉络丛”脑功能分区免疫荧光图(激光共聚焦显微镜下拍摄)。类脑器官培养至75天，进行冰冻切片及免疫荧光染色，显示已表达前脑和脉络丛标记物，提示已形成脑功能分区，即成功构建类脑器官。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1：类脑器官的培养根据参考文献(Nature2013；501:373-379和NatProtoc2014；9:2329-2340)，经一系列摸索和改进，先后采用超低吸附孔板和旋转生物发生器培养系统，人多能干细胞先后经历胚层分化、神经外胚层分化、神经上皮组织形成，已经在旋转发生瓶中诱导得到3D结构的人源化类脑器官，培养阶段如下。第一阶段：超低吸附96孔板内，按照活细胞密度6×104个/mL，每孔接种150μL，获得胚胎小体样细胞簇(图1，Day2所示)。第二阶段：继续诱导分化，胚胎小体开始出现胚层分化特征，进行诱导初始的神经上皮样组织(图1，Day5所示)，转移至超低吸附24孔板内继续培养。第三阶段：神经上皮样组织继续诱导分化，经历Matrigel胶滴包被的静态培养，形成神经上皮芽样组织，即开始进行类脑器官的分化(图1，Day15所示)。第四阶段：将上述包被Matrigel胶滴的组织转移至旋转发生瓶内，以85rpm的速度，继续培养。类脑器官组织进一步分化成熟，体积变大(图1，Day30所示)。随着培育时间的延长，类脑器官组织中神经干细胞比例逐渐减少，神经元比例增加(图2)，最终，类脑器官内形成脑功能分区，表达前脑标记物和脉络丛标记物(图3)，成功获得类脑器官。实施例2：类脑OGD模型模拟脑缺血实验方法：1.待类脑生长至第75天，吸弃细胞培养基，用1×PBS清洗两次后，肉眼及显微镜下观察类脑体积大小，并做标记。2.根据类脑体积对其进行分组，大小一致的类脑平均分布于各组。3.加入无糖DMEM培养基，并设置对照组，培养基中DMSO浓度≤1‰。4.放置于三气培养箱(1％O2、5％CO2、94％N2)中培养。5.培养至4h、6h、8h后测Caspase3activity或LDHRelease。测试方法：1.Caspase3activity测定该测定方法采用碧云天Caspase3活性检测试剂盒(货号：C1115)，内含：C1115-1裂解液8ml；C1115-2检测缓冲液8ml；C1115-3Ac-DEVD-pNA(2mM)200μl；C1115-4pNA(10mM)200μl。-20℃保存，Ac-DEVD-pNA和pNA需避光保存。(1).准备工作：a.裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。b.检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。(2).测定pNA标准曲线：a.标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。b.把试剂盒提供的pNA(10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。c.每个浓度取100μl用酶标仪进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类脑器官缺血模型的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将类脑器官加入无糖DMEM培养基中，所述培养基中DMSO浓度≤1‰，然后放置于培养箱中培养。

【技术特征摘要】
1.一种类脑器官缺血模型的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将类脑器官加入无糖DMEM培养基中，所述培养基中DMSO浓度≤1‰，然后放置于培养箱中培养。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述类脑器官为人源化类脑器官。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述人源化类脑器官为3D结构的人源化类脑器官。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述人源化类脑器官由人多能干细胞先后经历胚层分化、神经外胚层分化、神经上皮组织形成，并在旋转发生瓶中诱导得到3D结构的人源化类脑器官。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人源化类脑器官的制备方法包括以下步骤：(1)超低吸附孔板内接种人多能干细胞，获得胚胎小体样细胞簇；(2)继续诱导分化，胚胎小体样细胞簇开始出现胚层分化特征，形成初始的神经...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪朝玉，王淑娜，徐添颖，王治，
申请(专利权)人：上海风劲生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31