一种毛竹笋高活性线粒体的提取纯化及鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种毛竹笋高活性线粒体的提取纯化及鉴定方法。本发明专利技术提供了一种提取毛竹笋线粒体的方法，包括如下步骤：将毛竹笋依次进行匀浆、差速离心和蔗糖密度梯度离心，即得到纯化线粒体；所述差速离心采用离心力依次为1300‑1700g、5000‑7000g和12000‑15000g。本发明专利技术的方法对线粒体的损伤小，提取的线粒体活性高，对线粒体以外的细胞核组分、叶绿体或前质体组分、酚类和多糖等分离较为彻底，且从纯化的线粒体中可提取到高质量的线粒体RNA，这对后续的分子生物学实验，如PCR反应、cDNA文库构建、线粒体转录组研究等奠定了良好的基础。

Extraction, purification and identification of highly active mitochondria from bamboo shoots

The invention discloses a method for extraction, purification and identification of highly active mitochondria of bamboo shoots. The invention provides a method for extracting mitochondria of Phyllostachys pubescens shoot, which comprises the following steps: homogenizing, differential centrifuging and sucrose density gradient centrifuging the Phyllostachys pubescens shoot in order to obtain purified mitochondria; the differential centrifuging adopts the centrifugal forces of 1300 \u2011 1700g, 5000 \u2011 7000g and 12000 \u2011 15000g in order. The method of the invention has the advantages of small damage to mitochondria, high activity of extracted mitochondria, thorough separation of nuclear components, chloroplast or precursor components, phenols and polysaccharides, etc. other than mitochondria, and can extract high-quality mitochondrial RNA from purified mitochondria, which is useful for subsequent molecular biological experiments, such as PCR reaction, cDNA library construction, mitochondrial transcriptome research, etc It has laid a good foundation.

【技术实现步骤摘要】
一种毛竹笋高活性线粒体的提取纯化及鉴定方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种毛竹笋高活性线粒体的提取纯化及鉴定方法。
技术介绍
毛竹是我国种植面积最广的竹种，因生长速度快，产量高，力学性能好而深受青睐。毛竹笋是毛竹的幼体，竹笋生长是毛竹生长的初始阶段，也是毛竹速生成材的重要基础。毛竹笋在冬季处于休眠阶段，笋体不大，埋于土中，立春以后迅速长大，破土而出，其大小、颜色等形态特征发生了明显改变。毛竹笋的这一快速生长变化过程需要大量的能量支持，而线粒体作为植物体内能量代谢的重要细胞器及胞内ATP产生的主要场所，在此过程中无疑承担着关键性的作用。因此，提取高活性、高纯度的毛竹笋线粒体，对研究毛竹笋打破休眠，启动快速生长的能量代谢调控机制至关重要。目前，对线粒体提取及相关呼吸代谢、能量代谢的研究多集中在人和动物组织细胞中，对植物材料的研究较少。而且从现有的研究方法中，分离得到的线粒体绝大多数为粗提取的线粒体，含有来自细胞核，叶绿体或前质体等的污染，这对后续研究带来了很大干扰。线粒体作为植物细胞内相对独立的细胞器，包含自身特有的基因组及遗传信息。因此，分离纯化并鉴定高活性、高纯度的线粒体，对线粒体RNA的提取，cDNA文库的构建及从转录水平研究线粒体能量代谢机制是十分必要的，而现阶段针对毛竹笋高活性线粒体提取纯化及鉴定的方法还未有报道。
技术实现思路
为了提高一种毛竹笋高活性高纯度线粒体的提取纯化方法，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术一个目的是提供一种提取毛竹笋线粒体的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将毛竹笋依次进行匀浆、差速离心和蔗糖密度梯度离心，即得到纯化线粒体；所述差速离心采用离心力依次为1300-1700g、5000-7000g和12000-15000g。上述方法中，所述差速离心包括如下步骤：1)将过滤后滤液先1300-1700g离心5-15min，收集上清液；2)再将所述步骤1)收集的上清液5000-7000g离心10-15min，收集上清液；3)再将所述步骤2)收集的上清液12000-15000g离心10-15min，收集沉淀，得到粗提线粒体。上述匀浆为将毛竹笋与研磨缓冲液混合(按照每200mL研磨缓冲液150g样品的比例)，避光置于4℃冰箱过夜，再进行匀浆，得到浆液；上述匀浆条件为转速18000r/min，时间为2min，期间每开机5s暂停3s。其中，研磨缓冲液配方：1.25MNaCl，0.3M蔗糖，50mMTris-HCl，5mMEDTA，2mMEGTA，0.5％PVP-40，0.5％BSA，15mMβ-巯基乙醇，PH调至8.0。上述方法中，所述差速离心包括如下步骤：1)将过滤后滤液先1500g离心5-15min，收集上清液；2)再将所述步骤1)收集的上清液6000g离心10-15min，收集上清液；3)再将所述步骤2)收集的上清液15000g离心10-15min，收集沉淀，得到粗提线粒体；或，所述步骤1)和所述步骤2)均重复2-3次。或，在所述匀浆和所述差速离心之间还包括将所述匀浆的产物过滤，收集滤液的步骤。上述过滤为将匀浆得到的浆液采用无菌双层纱布过滤两次，收集滤液用于后期离心。上述方法中，所述蔗糖密度梯度离心包括如下步骤：将所述粗提线粒体悬浮，得到粗提线粒体悬浮液；再向离心管中依次加入质量体积百分含量40％蔗糖溶液、质量体积百分含量23％蔗糖溶液和所述粗线粒体悬浮液进行蔗糖密度梯度离心，收集处于23％蔗糖溶液上下分界层的溶液(上、下两层线粒体溶液)，得到纯化后分层的线粒体；所述蔗糖密度梯度离心的条件为：20,000g离心40-50min。悬浮采用的缓冲液为洗涤缓冲液；洗涤缓冲液配方：0.35M蔗糖，50mMTris-HCl，25mMEDTA，PH调至8.0。MTE缓冲液配方：400mM甘露醇，50mMTris-HCl，20mMEDTA，MTE缓冲液溶剂为蒸馏水，PH调至8.0。40％和23％蔗糖溶液的溶剂为MTE缓冲液。MTE缓冲液配方：400mM甘露醇，50mMTris-HCl，20mMEDTA，PH调至8.0。上述方法中，所述蔗糖密度梯度离心后还包括如下步骤：将所述蔗糖密度梯度离心收集的纯化后分层的线粒体经18,000g离心15-25min，收集沉淀，获得纯化线粒体。上述方法中，所述离心均为低温离心。上述方法中各个步骤均在低温条件下进行。本专利技术另一个目的是提供一种制备具有活性且纯化高的毛竹笋线粒体的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)上述提取纯化毛竹笋线粒体的方法，得到纯化线粒体；2)将所述纯化线粒体通过线粒体染色鉴定和线粒体特征基因扩增鉴定，从中选取线粒体染色显色且仅含有线粒体特征atp8基因且不含有毛竹核基因或毛竹叶绿体基因的线粒体，为具有活性且纯度高的线粒体。上述第二个目的的方法中，所述线粒体染色鉴定为用詹纳斯绿B法或罗丹明123法对所述纯化线粒体染色，选取线粒体染色显色的线粒体；或，所述线粒体特征基因扩增鉴定为用扩增线粒体特征atp8基因的引物、扩增毛竹核基因actin的引物和扩增毛竹叶绿体基因spbB的引物分别对所述纯化线粒体进行PCR扩增，选取仅含有线粒体特征atp8基因且不含有毛竹核基因或毛竹叶绿体基因的线粒体。上述第二个目的的方法中，所述詹纳斯绿B法采用詹纳斯绿B染液染色，所述染色条件为常温染色25-35min；在本专利技术的实施例中，常温染色30min。或，所述罗丹明123法采用罗丹明123染液染色，所述染色条件为30℃避光染色4-6min；在本专利技术的实施例中，30℃避光染色5min。詹纳斯绿B染液为质量体积百分含量为0.4％詹纳斯绿B染液，配制詹纳斯绿B染液的溶剂为自来水。罗丹明123染液为1mM罗丹明123染液，配制罗丹明123染液的溶剂为蒸馏水。或，所述扩增线粒体特征atp8基因的引物由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；或，所述扩增毛竹核基因actin的引物由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成；或，所述扩增毛竹叶绿体基因spbB的引物由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成。由上述方法制备的线粒体也是本专利技术保护的范围。上述提取毛竹笋线粒体方法在制备具有活性且纯化高的毛竹笋线粒体中的应用也是本专利技术保护的范围。上述具有活性且纯度高的线粒体为纯化线粒体染色显色，且PCR检测只能鉴定到线粒体基因且没有核基因和叶绿体基因的污染。上述线粒体在毛竹笋分子生物学研究中的应用也是本专利技术保护的范围；其中包括如PCR反应、cDNA文库构建、线粒体转录组等。本专利技术针对目前分离纯化线粒体的方法存在的不足，以及缺乏进一步对线粒体活性及纯度进行鉴定的现状，通过更改试剂、利用差速离心、蔗糖密度梯度离心、调整和细化离心次数和时间、优化线粒体活性染液浓度和染色时间、提取并鉴定线粒体RNA质量、用细胞器特异性基因PCR鉴定线粒体纯度等过程，提供了一套完整可靠的针对毛竹笋线粒体的提取、纯化、活性鉴定、纯度鉴定的方法。本专利技术的方法对线粒体的损伤小，提取的线粒体活性高，对线粒体以外的细胞核组分、叶绿体或前质体组分、酚类和多糖等分离较为彻底，且从纯化的线粒体中可提取到高质量的线粒体RNA，这对后续的分子生物学实验，如PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取毛竹笋线粒体的方法，包括如下步骤：将毛竹笋依次进行匀浆、差速离心和蔗糖密度梯度离心，即得到纯化线粒体；所述差速离心采用离心力依次为1300‑1700g、5000‑7000g和12000‑15000g。

【技术特征摘要】
1.一种提取毛竹笋线粒体的方法，包括如下步骤：将毛竹笋依次进行匀浆、差速离心和蔗糖密度梯度离心，即得到纯化线粒体；所述差速离心采用离心力依次为1300-1700g、5000-7000g和12000-15000g。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述差速离心包括如下步骤：1)将过滤后滤液先1300-1700g离心5-15min，收集上清液；2)再将所述步骤1)收集的上清液5000-7000g离心10-15min，收集上清液；3)再将所述步骤2)收集的上清液12000-15000g离心10-15min，收集沉淀，得到粗提线粒体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述差速离心包括如下步骤：1)将过滤后滤液先1500g离心5-15min，收集上清液；2)再将所述步骤1)收集的上清液6000g离心10-15min，收集上清液；3)再将所述步骤2)收集的上清液15000g离心10-15min，收集沉淀，得到粗提线粒体；或，所述步骤1)和所述步骤2)均重复2-3次；或，在所述匀浆和所述差速离心之间还包括将所述匀浆的产物过滤，收集滤液的步骤。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述蔗糖密度梯度离心包括如下步骤：将所述粗提线粒体悬浮，得到粗提线粒体悬浮液；再向离心管中依次加入质量体积百分含量40％蔗糖溶液、质量体积百分含量23％蔗糖溶液和所述粗线粒体悬浮液进行蔗糖密度梯度离心，收集处于23％蔗糖溶液上下分界层的溶液，得到纯化后分层的线粒体；所述蔗糖密度梯度离心的条件为：20,000g离心40-50min。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蔗糖密度梯度离心后还包括如下步骤：将所述蔗糖密度梯度离心收集的纯化后分层的线粒体经18,000g离心1...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢存福，王晓静，崔洪玮，耿新，杨颖，于婷乔，陈玉珍，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11