一种羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性胰岛β细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术公布了一种利用人羊膜上皮干细胞诱导分化为具有生物功能的胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：1)羊膜上皮干细胞的分离、培养、扩增、鉴定；2)体外诱导分化：实验选择第2～3代羊膜上皮干细胞，用含有尼克酰胺的培养基进行诱导分化。经体外14天分化得到能够表达胰岛β细胞特异性标志物及具有正常胰岛β细胞功能的胰岛素分泌细胞；3)体内移植：将诱导产生的胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病小鼠体内，可明显缓解小鼠高血糖状态。

A method of inducing and differentiating amniotic epithelial stem cells into functional islet \u03b2 cells and its application

The invention discloses a method for inducing and differentiating human amniotic epithelial stem cells into islet \u03b2 cells with biological functions, which comprises the following steps: 1) isolation, culture, amplification and identification of amniotic epithelial stem cells; 2) induction and differentiation in vitro: the second to third generation amniotic epithelial stem cells are selected in the experiment, and the culture medium containing nicotinamide is used for inducing and differentiation. After 14 days differentiation in vitro, insulin secreting cells which can express the specific markers of islet \u03b2 cells and have the function of normal islet \u03b2 cells were obtained; 3) in vivo transplantation: the induced insulin secreting cells were transplanted into type 1 diabetic mice, which can significantly alleviate the hyperglycemia of mice.

【技术实现步骤摘要】
一种羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性胰岛β细胞的方法及其应用
本专利技术涉及一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化胰岛β细胞的方法。
技术介绍
随着人民生活水平的提高和运动量的减少等原因，近年来，糖尿病发病率不断上升。据2013年的统计，全球患糖尿病的人数已经超过3.82亿，我国的糖尿病患者高达1.14亿人，总数位居世界第一。在我国城市人口中，成年人糖尿病发病率接近12％，并且还在以每年3％-5％的速度迅速增加。因此，糖尿病作为一个世界性的疾病正危害着许多患者的生命。糖尿病的发病原因十分复杂，与环境、遗传等诸多因素有关，至今尚不清楚其发病机制。糖尿病主要表现为以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，其血糖增高的原因有胰岛素分泌或作用的缺陷，或者两者同时存在。临床上将糖尿病分为1型、2型、其他特殊类型和妊娠期糖尿病等。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，胰岛中分泌胰岛素的β细胞由于自身免疫攻击而被永久性损坏，导致胰岛素分泌不足，1型糖尿病约占糖尿病患者总数的5％。2型糖尿病是由于胰岛产生胰岛素不足或身体组织对正常水平或高水平的胰岛素产生抵抗作用，导致胰岛素相对缺乏。在2型糖尿病的晚期阶段，胰岛β细胞数量减少约50％。国内外学者对糖尿病进行了大量研究工作，探讨其发病机理，寻找有效治疗措施，然而迄今对糖尿病确切病因和发病机制尚无满意阐述，治疗上也因存在许多瓶颈而无安全有效措施。目前胰岛素注射是临床上治疗糖尿病的主要方法，可以短期内控制血糖。不足之处是需要频繁监测血糖及注射胰岛素，而且不能阻止糖尿病所引起的肾衰、心脏病变、眼底病变、坏疽等并发症的发生和发展。治疗糖尿病的理想方法是恢复功能胰岛β细胞的数量。近年来胰腺移植和胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了很大进展，可有效改善患者内源性胰岛素的分泌，改善患者生活状态，更重要的是能减少和改善糖尿病的并发症。胰岛移植最大的问题就是胰岛供体来源严重不足和无法解决移植后出现的免疫排斥和副作用等问题。因此，找到一种能够大量生产运用于临床的胰岛细胞的方法迫在眉睫。干细胞的发现打破了传统观念，为治愈糖尿病等难治性疾病带来了新希望。至今已经有经由经血干细胞、脐血间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多能性干细胞等向胰岛β细胞方向分化的报道。然而经血和脐血来源有限、胚胎干细胞存在伦理问题及致瘤性、诱导多能性干细胞存在致瘤性，使得这些细胞很难真正用于临床。2005年，Toshio等研究证实人羊膜上皮细胞符合干细胞的标准。表达胚胎干细胞标志物如SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、SOX2、Oct-4、Nanog等，表达间充质干细胞标志物如CD29、CD73、CD105等，同时表达上皮干细胞标志物CK7、E-cadherin等；但部分间充质干细胞标志物(CD90)和造血干细胞表面标志物(如CD34和CD45)则为阴性。羊膜上皮干细胞体外可长期培养且保持染色体组型稳定，其增殖分化潜能明显高于脐血、骨髓和脂肪等来源的间充质干细胞。羊膜上皮干细胞不表达HLA-DR(humanleukecyteantigen-antigenDrelated)，低表达HLA-ABC(humanleukocyteantigenclassI)，NOD-SCI(nonobesediabeticseverecombinedimmunodeficient)小鼠体内移植不产生畸胎瘤，说明其免疫原性低、无致瘤性，这为细胞移植的安全性提供了一定的保证。羊膜上皮干细胞能通过非入侵性手段轻易获得，能利用标准的实验室条件达到很好的扩增和定向分化结果。目前，已有研究报道羊膜上皮干细胞具有向三个胚层分化的潜能。Gao等研究发现羊膜上皮干细胞体外可定向分化为具有生物功能的神经细胞，将这些细胞移植进入脊髓损伤模型中可修复损伤。TAN等发现羊膜上皮干细胞可分泌多种因子，具有强大的免疫调节性能，可影响巨噬细胞的极性及活性，其分泌的LXA4在极性肺损伤中发挥重要作用；Mary等发现羊膜上皮干细胞可直接调节大脑的小胶质细胞，释放营养因子，修复脑损伤；Miki等发现羊膜上皮干细胞可分化为胆管上皮细胞，体内移植后可治疗慢性胆汁阻塞。羊膜上皮干细胞不表达HLA-DR，低表达HLA-ABC，说明其免疫原性低、这为降低或解决异体细胞移植后所产生的排斥反应提供了重要的细胞来源。羊膜上皮干细胞是新近发现的成体干细胞的一种，属于上皮干细胞。羊膜组织中发现存在丰富的上皮干细胞，可从胎儿分娩后废弃的羊膜上快速的分离，是一种无创、安全的干细胞来源方式。在细胞标志分子表达和分化能力上，羊膜上皮干细胞与胚胎干细胞最为相似。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化为功能性胰岛β细胞的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用羊膜上皮干细胞诱导分化为胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：A.将第2～3代生长状态良好的羊膜上皮干细胞用胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时即以含体积浓度10％胎牛血清(FBS，ThermoFisher，10099-141)的DMEM培养基(ThermoFisher，10569044)终止消化，离心，所得细胞沉淀用PBS清洗1次；B.将上述步骤A中所得的细胞沉淀接种于10cm培养皿中进行诱导培养，接种细胞密度为1×106/皿，每皿加入10ml分化诱导培养基I，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基I，更换为10ml的诱导培养基Ⅱ，每2天换液，共12天；每天在倒置显微镜下观察细胞状态，诱导时间为14天，得到具有胰岛β细胞功能的胰岛素分泌细胞；所述诱导培养基I的制备方法为：在34.32mlDMDM(Dulbecco’sModifiedDulbecco'sMedium，ThermoFisher，12440053)中加入4mlFBS(10％)、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸(NEAA，ThermoFisher，11140050)、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺(L-glutaminne，ThermoFisher，21051024)、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，Sigma，M6250)、0.4ml双抗(含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素)、400ng人表皮生长因子(EGF，peprotech，AF-100-15-100)、0.4ml浓度为1M的尼克酰胺(nicotinamide，Sigma，N0636)；所述诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在34.36mlDMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、0.4ml浓度为1M的尼克酰胺。所述人羊膜上皮干细胞获得方法为：A、羊膜收集：将从胎盘上剥离的羊膜，放入含有抗生素的PBS中，室温下处理1-2小时，用PBS洗羊膜3次，每次将羊膜转移到含有新鲜PBS的烧杯中；B、原代培养1)将步骤A中所得的羊膜转移到50ml离心管中，加入30ml新鲜预热的胰酶/ED本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用人羊膜上皮干细胞诱导分化功能性胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.将第2～3代生长状态良好的羊膜上皮干细胞用胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时即以含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得细胞沉淀用PBS清洗1次；B.将上述步骤A中所得的细胞沉淀接种于10cm培养皿中进行诱导培养，接种细胞密度为1×10

【技术特征摘要】
1.利用人羊膜上皮干细胞诱导分化功能性胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.将第2～3代生长状态良好的羊膜上皮干细胞用胰酶消化，当显微镜下见细胞为单个圆形时即以含体积浓度10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，所得细胞沉淀用PBS清洗1次；B.将上述步骤A中所得的细胞沉淀接种于10cm培养皿中进行诱导培养，接种细胞密度为1×106/皿，每皿加入10ml分化诱导培养基I，然后置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；2天后吸弃诱导培养基I，更换为10ml的诱导培养基Ⅱ，每2天换液，共12天；每天在倒置显微镜下观察细胞状态，诱导时间为14天，得到具有胰岛β细胞功能的胰岛素分泌细胞；所述诱导培养基I的制备方法为：在34.32mlDMDM中加入4mlFBS(10％)、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗，所述双抗为含10,000U/ml苄青霉素纳和10,000μg/ml链霉素、400ng人表皮生长因子、0.4ml浓度为1M的尼克酰胺；所述诱导培养基Ⅱ的制备方法为：在34.36mlDMDM中加入4ml胎牛血清、0.4ml浓度为100mM的非必需氨基酸、0.4ml浓度为200mM的L-谷氨酰胺、0.04μl浓度为55mM的2-巯基乙醇、0.4ml双抗、0.4ml浓度为1M的尼克酰胺。2.根据权利要求1所述的利用羊膜上皮干细胞诱导分化胰岛β细胞的方法，其特征是所述人羊膜上皮干细胞获得方法为：A、羊膜收集：将从胎盘上剥离的羊膜，放入含有抗生素的PBS中，室温下处理1-2小时，用PBS洗羊膜3次，每次将羊膜转移到含有新鲜PBS的烧杯中；B、原代培养1)将步骤A中所得的羊膜转移到50ml离心管中，加入30ml新鲜预热的胰酶/EDTA，37℃水浴锅中孵育，每隔10分钟振荡器上震荡1次；40分钟后加入2倍体积的含有10％FBS的DMEM培养基终止消化；2)将步骤1)中所得的细胞悬液离心去上清，加入7-8ml羊膜上皮干细胞培养基，接种于10cm细胞培养皿中，置于5％CO2、95％湿度、37℃培养箱中培养；C、细胞传代培养：一旦步骤B)原代培养的细胞生长至70％-80％汇合度时，即采用胰酶消化传代，具体步骤如下：1)旦步骤B)原代培养的细胞生长至70％-80％汇...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛洪波，李婧嫄，柳全文，刘倩玉，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36