一种鸭小肠上皮细胞的培养方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种鸭小肠上皮细胞的培养方法及应用，属于细胞分离培养技术领域及细胞毒理技术领域。本发明专利技术的细胞培养方法结合酶消化和组织块吹打的方法获取鸭小肠上皮原代细胞，克服了现有方法培养鸭原代小肠上皮细胞活力低，无法进行细胞转染的问题，原代细胞培养成功，细胞纯度达到95%以上，成功建立了鸭小肠上皮细胞培养方法；且利用培养的原代鸭小肠上皮细胞，通过时效和量效试验，测试双氧水浓度和作用时间对细胞活力和细胞凋亡情况的影响，确定了适于小肠上皮细胞的造模方案，建立了鸭原代小肠上皮细胞氧化应激模型，为以后研究鸭肠道损伤的分子机制提供基础。

A culture method of duck intestinal epithelial cells and its application

【技术实现步骤摘要】
一种鸭小肠上皮细胞的培养方法及应用
本专利技术属于细胞分离培养
及细胞毒理
，具体涉及一种鸭原代小肠上皮细胞的培养方法，还涉及一种鸭小肠上皮细胞氧化应激模型的建立方法。
技术介绍
随着畜禽规模化养殖的发展，转群、免疫、运输、限制饲喂等成为标准化养殖的重要环节，这些生产环节可诱发动物出现氧化应激反应。此外，养殖舍小环境受到外界环境因素影响，如夏季高温，冬季的低温等也可诱发机体氧化应激反应。机体氧化应激是由于体内产生过多的活性氧自由基或活性氮自由基，超过了机体自由基清除能力，造成机体氧化和抗氧化系统失衡。家禽出现氧化应激反应后，生产性能降低，如果应激进一步加重，还可能发生应激性综合征，甚至死亡，造成养殖企业经济损失。氧化应激损伤主要发生在心血管、消化、内分泌和免疫系统。小肠组织在应激时最早发生缺血，又最迟得到恢复，是机体应激过程中器官功能障碍的中心。氧化应激导致动物采食量减少、饲料转化率下降。许多研究均证明，动物机体受到外来环境刺激时，由于肠道组织缺血，易发生氧化应激，进而造成结构和功能的紊乱，影响消化和吸收，但此研究仅仅限于在动物活体上，小肠发生氧化应激时的细胞应答机制尚不明晰。国内外尚无鸭原代小肠上皮细胞的原代培养报道，其他动物物种上皮细胞分离及培养方法虽有报道，但消化酶的选择、培养液的制备以及分离过程方法各异。申请号201510982770.5申请了一种鸡小肠上皮细胞的分离及原代培养方法，该培养方法采用嗜热菌蛋白酶对鸡小肠组织进行消化，通过对酶消化液中的细胞团进行处理后，将获取的细胞用10%的鸡血清培养基培养于40℃，7%CO2培养箱中。但是该方法所使用的嗜热菌蛋白酶价格昂贵，且该专利技术使用的血清主要通过活鸡屠宰后取血分离的方法获得，获取时环境可控性差，血清质量稳定性差。本专利技术申请人采用该方法分离鸭原代小肠上皮细胞时，获取的鸭小肠上皮细胞活力低，不能有效的贴壁生长，无法进行后续的细胞转染、RNA提取、蛋白提取等操作。申请号201610560871.8申请了蛋鸡输卵管膨大部上皮细胞培养及氧化应激模型建立方法，该方法利用胶原酶IV消化剪碎的输卵管上皮细胞，同样将消化后的消化液过滤，滤液进行离心后弃上清液得到细胞。该方法同样存在所获得的细胞活力低的问题。因此建立高效的鸭小肠上皮细胞分离培养方法，是研究氧化应激过程中分子机制的基础。同时，选优的鸭小肠上皮细胞氧化应激模型的建立，是小肠上皮细胞氧化应激应答机制研究的对象。目前，已经有通过许多添加重金属、过氧化氢等方式建立氧化应激模型的先例，但是不同的组织细胞的抗氧化能力差异较大，尤其是原代培养的细胞，由于增殖分化能力比细胞系弱，需要研究建立氧化应激的合适方式、浓度和处理时间，以此研究小肠上皮细胞在氧化应激过程中应答机制。申请号201610901262.4申请了过氧化氢诱导的猪脾细胞氧化应激模型的建立方法，该方法使用猪脾细胞作为过氧化氢诱导氧化应激的造模细胞，过氧化氢浓度为50-450μM。猪脾细胞在种属和选取的细胞类型上与鸭小肠上皮细胞差别很大，细胞造模有其特异性。因此，鉴于上述原因，为了进一步探究氧化应激造成鸭肠道上皮细胞氧化应激的应答机制，有必要建立鸭小肠上皮细胞的体外氧化应激模型，为揭示细胞氧化应激过程中的细胞信号转导和转录调控机制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的一个技术问题是现有分离小肠上皮细胞的方法无法获得高活性可处理的鸭原代小肠上皮细胞的问题，建立了一种鸭小肠上皮细胞的培养方法，具体包括以下步骤：步骤1，取孵化26天的麻鸭种蛋，无菌操作取出鸭胚小肠组织，置于DPBS中；步骤2，去除组织中的小肠系膜和胰腺后，将小肠剖开再次用DPBS漂洗，洗至上清液清亮，并将小肠剪碎成1-3mm3的组织块后备用；步骤3，采用1mg/ml的I型胶原酶消化剪碎的组织团块，37℃，80r/min振荡消化70min；步骤4，使用DPBS轻柔清洗消化后的组织团块2次，弃除DPBS，保留组织块；步骤5，37℃的DPBS轻轻吹打清洗后的组织团块，收集上层细胞悬浮液，保留组织块继续使用DPBS清洗，重复本步骤7-8次，直至上清液清亮；步骤6，收集获得的细胞悬浮液1000r/min离心3min，弃上清；步骤7，离心获得的细胞（团）用完全培养基培养吹打重悬，过100μm网筛过滤；步骤8，过筛后的细胞轻轻吹打均匀后，将其接种到细胞培养瓶中，37℃，5%CO2条件下培养90min，去掉贴壁细胞；步骤9，收集未贴壁细胞，细胞按照10×106/mL密度接种于细胞培养板，37℃，5%CO2培养24小时。进一步的，如上所述的一种鸭小肠上皮细胞培养方法，所述步骤3中的I型胶原酶消化液为：100mgI型胶原酶溶解于1mL的PBS缓冲液中，吹打混匀后，分装为200μL备用；使用前，将其溶解于20mL的PBS中，即完成I型胶原酶消化液制备。进一步的，如上所述的一种鸭小肠上皮细胞培养方法，所述步骤7中的鸭小肠上皮细胞完全培养基为：46.65mLDMEM/F12，2.5mLFBS，0.25mL肝素钠（100μg/mL），0.05mLEGF（105ng/ml），0.05mL胰岛素（25mg/ml），0.5ml青链霉素（10000U）。本专利技术要解决的另一技术问题是提供一种过氧化氢诱导的鸭小肠上皮细胞氧化应激模型建立方法，为后续深入研究氧化应激造成肠道上皮细胞损伤的应答机制提供较为理想的体外模型。一种鸭小肠上皮细胞的氧化应激模型建立方法，采用过氧化氢诱导处理鸭原代小肠上皮细胞，所述过氧化氢浓度为200μM，处理时间为4h。优选地，如上所述的一种鸭小肠上皮细胞的氧化应激模型建立方法，所述氧化应激模型建立方法为：使用培养24h的鸭原代小肠上皮细胞，分别设对照组和氧化应激处理组，用不含双抗的完全培养基对细胞进行半换液，37℃，5%CO2培养箱中培养12h，保证细胞活力；实验组每孔加入DMEM/F12稀释的过氧化氢，过氧化氢浓度为200μM；空白对照组加入等量的DMEM/F12，37℃，5%CO2条件下孵育4h，采用CCK8法检测细胞存活率，用分光光度计检测相关的细胞氧化应激指标。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：（1）本专利技术的鸭原代小肠上皮细胞培养方法科学合理，结合酶消化和组织块吹打的方法获取细胞，克服了现有方法培养鸭小肠上皮细胞活力低，无法进行细胞转染的问题，原代细胞培养成功，细胞纯度达到95%以上。（2）本专利技术利用培养的鸭原代小肠上皮细胞，通过时效和量效实验，检测不同双氧水浓度和不同作用时间对细胞活力和细胞凋亡情况的影响，确定了适于小肠上皮细胞的造模方案，为进一步探究肠上皮氧化应激应答机制奠定基础。（3）本专利技术通过培养鸭原代小肠上皮细胞，建立了小肠上皮细胞氧化应激模型，为以后研究鸭肠道氧化应激提供体外模型，为研究应对鸭养殖过程中由于鸭肠道氧化应激造成的生产性能下降的策略，提供技术支撑。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术实施例1中所培养的鸭原代小肠上皮细胞图片。图2是本专利技术实施例2中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭小肠上皮细胞的培养方法，其特征在于：该培养方法包括如下步骤：步骤1，取孵化26天的麻鸭种蛋，无菌操作取出鸭胚小肠组织，置于DPBS中；步骤2，去除组织中的小肠系膜和胰腺后，将小肠剖开再次用DPBS漂洗，洗至上清液清亮，将小肠剪碎后备用；步骤3，采用1mg/ml的I型胶原酶消化剪碎的组织团块，37℃，80 r/min振荡消化70min；步骤4，使用DPBS轻柔清洗消化后的组织团块2次，弃除DPBS，保留组织块；步骤5，37℃ 的DPBS轻轻吹打清洗后的组织团块，收集上层细胞悬浮液，保留组织块继续使用DPBS清洗，重复本步骤7‑8次，直至上清液清亮；步骤6，收集获得的细胞悬浮液1000 r/min离心3 min，弃上清；步骤7，离心获得的细胞团用完全培养基培养吹打重悬，过100μm网筛过滤；步骤8，过筛后的细胞轻轻吹打均匀后，将其接种到细胞培养瓶中，37℃，5% CO2条件下培养90min，去掉贴壁细胞；步骤9，收集未贴壁细胞，细胞按照10×10

【技术特征摘要】
2018.09.30 CN 20181115744931.一种鸭小肠上皮细胞的培养方法，其特征在于：该培养方法包括如下步骤：步骤1，取孵化26天的麻鸭种蛋，无菌操作取出鸭胚小肠组织，置于DPBS中；步骤2，去除组织中的小肠系膜和胰腺后，将小肠剖开再次用DPBS漂洗，洗至上清液清亮，将小肠剪碎后备用；步骤3，采用1mg/ml的I型胶原酶消化剪碎的组织团块，37℃，80r/min振荡消化70min；步骤4，使用DPBS轻柔清洗消化后的组织团块2次，弃除DPBS，保留组织块；步骤5，37℃的DPBS轻轻吹打清洗后的组织团块，收集上层细胞悬浮液，保留组织块继续使用DPBS清洗，重复本步骤7-8次，直至上清液清亮；步骤6，收集获得的细胞悬浮液1000r/min离心3min，弃上清；步骤7，离心获得的细胞团用完全培养基培养吹打重悬，过100μm网筛过滤；步骤8，过筛后的细胞轻轻吹打均匀后，将其接种到细胞培养瓶中，37℃，5%CO2条件下培养90min，去掉贴壁细胞；步骤9，收集未贴壁细胞，细胞按照10×106/mL密度接种于细胞培养板，37℃，5%CO2培养24小时。2.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昊，陈芳，吴艳，袁杰，梁振华，皮劲松，申杰，潘爱銮，杜金平，孙静，蒲跃进，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42