【技术实现步骤摘要】
一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法
本专利技术涉及一种成纤维细胞的培养方法,尤其涉及一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法。
技术介绍
成纤维细胞,也称为纤维母细胞,是疏松结缔组织的主要细胞成分,属于终末分化细胞,这种细胞会分泌胶原蛋白等蛋白质。在人体的细胞中成纤维细胞数目最多,胞体大,为多突的纺锤形或星形的扁平细胞,细胞核呈规则的卵圆形,细胞轮廓不清,具有突起。其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大,胞质弱嗜碱性,胞核较大呈椭圆形,染色质疏松着色浅,核仁明显。电镜下,其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体,表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用,聚合和重排,可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维,胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。除此之外,成纤维细胞可分泌多种细胞生长因子,如碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮细胞生长因子等,这些细胞生长因子可进一步促进细胞再生,加快组织修复,故其在组织损伤修复和美容中起到至关重要的作用。目前研究者们已针对于此做了很多研究,并已取得了多项积极的成果,这些研究结果已证实上述结论。针对于这些研究结果,研究者们正在积极的采用成纤维细胞开发用于组织修复和美容的产品,但在开发这些产品中成纤维细胞的来源、活性及纯度对产品的疗效都起到决定性的作用,而目前开发的产品成纤维细胞大部分来源于人体皮肤、易对人体表面造成创伤及疤痕,同时其现有技术培养的成纤维 ...
【技术保护点】
1.一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)组织采集:从口腔粘膜组织中采集样本;用磷酸盐缓冲液加抗生素洗涤黏膜组织,随后将洗净的组织放置到含二甲基亚砜、胎牛血清和培养基的保存溶液中,液氮保存;(2)原代培养:使用75%酒精短时消毒新鲜解冻的黏膜组织,随后用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液进行洗涤,切成小块,在室温下,在轻微水平摇动下使用I型,II型胶原酶和II型分散酶的组合物进行过夜消化,以使原代培养组织破碎;将过夜消化后的组织在含血清的专用培养基中培养10‑20天;(3)细胞纯化培养:当(2)中的细胞融合度达到50%以上时,加蛋白酶消化,在显微镜下观察细胞形态,终止消化;将细胞传代到培养瓶中培养7‑10d,当细胞融合度达到85%以上时,收获细胞,此时细胞为第一代细胞P1;将第一代细胞传代到培养瓶中,培养3‑4d,当细胞融合度达到85%以上时,收获细胞,此时细胞为第二代细胞P2;在自动细胞扩增系统中将第二代细胞继续扩增5‑7天,在培养过程中每天检测乳酸值,当乳酸值显示培养的细胞达到亚饱和状态时,收获细胞,此时收获的细胞为所需数量的第三代细胞P3,即成纤维细胞。
【技术特征摘要】
1.一种用口腔黏膜组织培养成纤维细胞的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)组织采集:从口腔粘膜组织中采集样本;用磷酸盐缓冲液加抗生素洗涤黏膜组织,随后将洗净的组织放置到含二甲基亚砜、胎牛血清和培养基的保存溶液中,液氮保存;(2)原代培养:使用75%酒精短时消毒新鲜解冻的黏膜组织,随后用不含钙和镁的磷酸盐缓冲液进行洗涤,切成小块,在室温下,在轻微水平摇动下使用I型,II型胶原酶和II型分散酶的组合物进行过夜消化,以使原代培养组织破碎;将过夜消化后的组织在含血清的专用培养基中培养10-20天;(3)细胞纯化培养:当(2)中的细胞融合度达到50%以上时,加蛋白酶消化,在显微镜下观察细胞形态,终止消化;将细胞传代到培养瓶中培养7-10d,当细胞融合度达到85%以上时,收获细胞,此时细胞为第一代细胞P1;将第一代细胞传代到培养瓶中,培养3-4d,当细胞融合度达到85%以上时,收获细胞,此时细胞为第二代细胞P2;在自动细胞扩增系统中将第二代细胞继续扩增5-7天,在培养过程中每天检测乳酸值,当乳酸值显示培养的细胞达到亚饱和状态时,收获细胞,此时收获的细胞为所需数量的第三代细胞P3,即成纤维细胞。2.根据权利要求1中所述的培养成纤维细胞的方法,其特征在于所述自动细胞扩增体系中的培养过程为:将第二代细胞的1×107-2×107个细胞转移到自动细胞扩增体系中,其系统为全封闭系统,在5%CO2、37℃条件下进行培养,在培养过程中通过测量产生的乳酸或吸收的葡萄糖情况,判断系统内细胞的生长情况,当细胞数量达到2×108-8×108个细胞,并且细胞仍处于指数生长期时,使用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收获细胞,将收获的细胞在无菌PBS中洗涤并进行细胞计数,其细胞活力>95%,具有典型的成纤维细胞形态。3.根据权利要求1所述的培养成纤维细胞的方法,其特征在于所述的细胞纯化培养的过程为:待步骤(2)中制得的口腔黏膜成纤维原...
【专利技术属性】
技术研发人员:施松涛,王新荣,孙中锋,
申请(专利权)人:西安新长安再生医学科技研发有限公司,
类型:发明
国别省市:陕西,61
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