一种靶向缺血心肌的VEGF重组蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向缺血心肌的VEGF重组蛋白。本发明专利技术提供了一种融合蛋白，由VEGF165和靶向多肽IMT及用于连接二者的连接肽组成；本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术设计并验证了一个全新的缺血心肌靶向的重组VEGF蛋白IMT-VEGF，它能够通过静脉注射靶向到梗死区域从而增加VEGF有效的局部浓度。这是一种很有应用前景的可用于靶向疗法的重组VEGF蛋白，可通过静脉注射靶向到缺血的心肌组织，促进损伤的修复和心脏功能的恢复。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医疗领域，具体涉及一种靶向缺血心肌的VEGF重组蛋白的构建方法与应用。
技术介绍
心肌梗死(myocardialinfarction，MI)在全球是发病率和致死率最高的疾病之一(Goetal.,2014)，严重威胁人类的健康和生存，而针对心肌梗死的治疗目前还没有有效的方法。重建梗死部位的血循环系统，诱导心肌再生是心肌梗死治疗策略中非常重要的方面。临床上主要以血管成形术或侧枝手术来恢复血供(vanderSpoeletal.,2011)，用生长因子诱导治疗性的血管再生也是一种极具潜力的方法。血管内皮生长因子(vascularendotheliagrowthfactor，VEGF)是最有效的促进血管再生的细胞因子之一，同时它也可以抑制细胞凋亡并介导心肌前体细胞的迁移和分化(Ramakrishnanetal.,2014；Yla-Herttualaetal.,2007)。但是VEGF在体内极易扩散，使得局部浓度降低，也增加了潜在的风险。在对心肌梗死的治疗中，很多报道都证明了VEGF基因或重组蛋白在动物模型中有效加强了侧支灌注，减小了梗死面积，改善了心功能。但是在临床试验中，VEGF重组蛋白因为极易扩散而呈现出剂量依赖的效应(Hendeletal.,2000；Henryetal.,2003；Jacquieretal.,2007；Lopezetal.,1998)，而高浓度的VEGF又可能会有副作用(Leeetal.,2000；Matsunoetal.,2002)。针对这些缺陷，如何进行靶向治疗，降低扩散导致的风险，是有效安全地应用VEGF所必需考虑的问题。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种融合蛋白。本专利技术提供的融合蛋白，命名为IMT-VEGF，为如下a或b：a)、所述融合蛋白包括VEGF165和靶向多肽IMT及用于连接二者的连接肽；b)、所述融合蛋白为a)所示融合蛋白的C端融合标签蛋白得到的融合蛋白；所述VEGF165的氨基酸序列为序列表中序列2第1-166位氨基酸；所述靶向多肽IMT的氨基酸序列为序列表中序列2第178-186位氨基酸。上述融合蛋白中，a)、所述融合蛋白依次包括VEGF165、连接肽和靶向多肽IMT；b)、所述融合蛋白依次包括VEGF165、连接肽、靶向多肽IMT和6个His标签。上述融合蛋白为如下1)或2)或3)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)序列表中序列2第1-186位氨基酸残基所示的蛋白质；3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)或2)所示序列衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加编码上述融合蛋白的DNA分子也是本专利技术保护的范围。上述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)编码区为序列表中序列1第4-558位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。上述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围。上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体，在本专利技术的实施例中，重组载体为将序列表中序列1所示的融合蛋白IMT-VEGF编码基因替换pET28a载体的XbaI和XhoI酶切位点间的DNA分子得到的载体，命名为pET28a-IMT-VEGF，表达融合蛋白IMT-VEGF。扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本专利技术保护的范围。上述融合蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备具有如下1)-9)中至少一种功能的产品中的应用也是本专利技术保护的范围：1)刺激内皮细胞增殖；2)提高VEGF的心肌靶向性；3)治疗动物心肌损伤；4)提高α-smoothmuscleactin阳性的成熟血管数目，5)提高vonWillebrandFactor阳性的毛细血管数目；6)促进心脏梗死区域血管再生；7)提高心肌细胞的存活；8)抑制心脏梗死边缘区域的细胞凋亡；9)增加VEGF有效的局部浓度。上述心肌损伤为心肌梗死。本专利技术的另一个目的是提供一种具有如下1)-9)中至少一种功能的产品。本专利技术提供的产品，其包括上述融合蛋白、上述DNA分子、上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌：1)刺激内皮细胞增殖；2)提高VEGF的心肌靶向性；3)治疗动物心肌损伤；4)提高α-smoothmuscleactin阳性的成熟血管数目，5)提高vonWillebrandFactor阳性的毛细血管数目；6)促进心脏梗死区域血管再生；7)提高心肌细胞的存活；8)抑制心脏梗死边缘区域的细胞凋亡；9)增加VEGF有效的局部浓度。所述产品为试剂盒。本专利技术的实验证明，本专利技术设计并验证了一个全新的缺血心肌靶向的重组VEGF蛋白IMT-VEGF，它能够通过静脉注射靶向到梗死区域从而增加VEGF有效的局部浓度。在体外检测了它的生物学活性并在体内验证了它募集到缺血损伤部位的靶向能力。利用大鼠的心脏缺血再灌注模型，证明了静脉注射该融合蛋白可以有效减少梗死面积，增加梗死区域的血管再生和心肌存活，促进心功能的恢复。这是一种很有应用前景的可用于靶向疗法的重组VEGF蛋白，可通过静脉注射靶向到缺血的心肌组织，促进损伤的修复和心脏功能的恢复。附图说明图1为IMT-VEGF蛋白的表达及活性检测。图2为IMT-VEGF蛋白在缺血心肌组织富集。图3为IMT-VEGF蛋白靶向到缺血心肌。图4为IMT-VEGF蛋白静脉显著减小大鼠心肌梗死面积。图5为IMT-VEGF蛋白促进大鼠心梗后的血管再生并抑制细胞凋亡。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、融合蛋白IMT-VEGF的获得1、融合蛋白IMT-VEGF融合蛋白IMT-VEGF包括VEGF165和靶向多肽IMT及连接二者的连接肽；融合蛋白IMT-VEGF也可以包括VEGF165、连接肽、靶向多肽IMT和6个His标签(图1A)。融合蛋白IMT-VEGF的氨基酸序列为序列2，序列2第1-166位为VEGF165、序列2第167-177位为连接肽、序列2第178-186位为靶向多肽IMT、序列2第187-188位为XhoI酶切识别位点编码的氨基酸残基、序列2第189-194位为6个His标签。融合蛋白IMT-VEGF编码基因的核苷酸序列为序列1，序列1第4-498位为VEGF165编码基因、序列1第499-531位为连接肽编码基因、序列1第532-558位为靶向多肽IMT编码基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，为如下a或b：a)、所述融合蛋白包括VEGF165和靶向多肽IMT及用于连接二者的连接肽；b)、所述融合蛋白为a)所示融合蛋白的C端融合标签蛋白得到的融合蛋白；所述VEGF165的氨基酸序列为序列表中序列2第1‑166位氨基酸；所述靶向多肽IMT的氨基酸序列为序列表中序列2第178‑186位氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，为如下a或b：a)、所述融合蛋白包括VEGF165和靶向多肽IMT及用于连接二者的连接肽；b)、所述融合蛋白为a)所示融合蛋白的C端融合标签蛋白得到的融合蛋白；所述VEGF165的氨基酸序列为序列表中序列2第1-166位氨基酸；所述靶向多肽IMT的氨基酸序列为序列表中序列2第178-186位氨基酸。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：a)、所述融合蛋白依次包括VEGF165、连接肽和靶向多肽IMT；b)、所述融合蛋白依次包括VEGF165、连接肽、靶向多肽IMT和6个His标签。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下1)或2)或3)：1)序列表中序列2所示的蛋白质；2)序列表中序列2第1-186位氨基酸残基所示的蛋白质；3)将1)或2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由1)或2)所示序列衍生的蛋白质。4.编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子。5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；2)编码区为序列表中序列1第4-558位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有9...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴建武，杨赟，陈冰，侯祥林，肖志峰，赵燕南，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11