诱导性多能干细胞的制作方法技术

根据本公开，提供一种诱导性多能干细胞的制作方法，其包含：准备体细胞的步骤；将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至体细胞的步骤。而且，根据本公开，提供一种诱导性多能干细胞的制作方法，其包含：准备体细胞的步骤；使用RNA转染试剂将启动因子RNA导入至体细胞的步骤；在凝胶培养基中对体细胞进行初始化的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导性多能干细胞的制作方法
本专利技术涉及细胞技术，涉及诱导性多能干细胞的制作方法。
技术介绍
所谓诱导性多能干(inducedpluripotentstem，iPS)细胞是具有两种特征能力的细胞。一种是能够变化为构成身体的任意细胞的能力。另一种是具有半永久性的增殖能力。由于iPS细胞具有这两种能力，故可以通过由自身的体细胞制作iPS细胞，使其变化为目标体细胞，从而应用于并无排斥反应的移植治疗中。因此，iPS细胞被认为是再生医疗的强大技术。从iPS细胞的诞生到现在，已经确立了很多其制作方法。作为代表性的iPS细胞的制作方法，可列举使用逆转录病毒/慢病毒的方法、及使用附加型载体的方法。对使用逆转录病毒/慢病毒的方法加以说明。可以使体细胞感染逆转录病毒或慢病毒，将编码启动因子的基因导入至细胞内。另外，逆转录病毒或慢病毒可以将启动因子插入到体细胞的基因组中，诱导启动因子在细胞内的稳定的表达。然而，在使用逆转录病毒/慢病毒的方法中存在以下的问题点。首先，将启动因子插入到体细胞的基因组中会损伤已有的基因或启动子，因此可能成为细胞癌变的原因。而且，插入到基因组上的启动因子可能在使iPS细胞变化为体细胞后再次活性化。因此，在来自iPS细胞的移植用细胞中存在癌变的风险。事实上，在小鼠模型中，在体细胞中观察到所导入的启动因子的再次活性化，且确认了癌变(例如参照非专利文献1)。附加型载体是环状DNA，在细胞核内进行自我扩增。至于附加型载体，尽管认为原则上并不并入到基因组中，但是在最近的研究中报告了如下现象：在由附加体生成的iPS细胞的基因组上，散布插入了附加型载体的片段。因此，存在重编程基因会残存于细胞内的问题。例如，如果c-MYC或KLF4残存于细胞内，则成为癌变的原因。检查重编程基因是否残存于细胞内需要高额的费用。不可能表明在移植细胞池中的所有细胞中，附加体质粒并未插入到基因组，并未残存。由于在使用逆转录病毒/慢病毒的方法、及使用附加型载体的方法中存在上述问题，因此提出了使用RNA制作iPS细胞的方法(例如参照非专利文献2)。现有技术文献非专利文献非专利文献1:Nature448,313-317非专利文献2:NatureBiotechnol26(3):313-315,2008.
技术实现思路
专利技术所欲解决的课题需要将启动因子RNA有效率地导入至体细胞的方法。本专利技术的目的之一在于提供适合临床应用的安全的诱导性多能干细胞的有效率的制作方法。解决问题的手段根据本专利技术的实施方式而提供一种诱导性多能干细胞的制作方法，其包含：准备体细胞的步骤；将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至在凝胶培养基中悬浮培养的体细胞。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至附着培养的体细胞。上述诱导性多能干细胞的制作方法可以进一步包含在凝胶培养基中对体细胞进行初始化的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，体细胞可以是纤维母细胞。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，体细胞可以是血液细胞。上述诱导性多能干细胞的制作方法可以进一步包含使用红血球分离剂，分离单核细胞作为体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以进一步包含使用过滤器，分离单核细胞作为体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以进一步包含使用免疫磁珠，分离单核细胞作为体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，启动因子RNA可以包含M3O或OCT3/4的mRNA、SOX2的mRNA、KLF4的mRNA、及c-MYC的mRNA。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以并不对凝胶培养基进行搅拌。凝胶培养基可以不含生长因子。凝胶培养基可以以40质量％以下的浓度含有生长因子。凝胶培养基可以不含bFGF。而且，根据本专利技术的实施方式，提供一种诱导性多能干细胞的制作方法，其包含：准备体细胞的步骤；使用RNA转染试剂将启动因子RNA导入至体细胞的步骤；及在凝胶培养基中对体细胞进行初始化的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，体细胞可以是纤维母细胞。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，体细胞可以是血液细胞。上述诱导性多能干细胞的制作方法可以进一步包含使用红血球分离剂，分离单核细胞作为体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以进一步包含使用过滤器，分离单核细胞作为体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以进一步包含使用免疫磁珠，分离单核细胞作为体细胞的步骤。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，启动因子RNA可以包含M3O或OCT3/4的mRNA、SOX2的mRNA、KLF4的mRNA、及c-MYC的mRNA。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以并不对凝胶培养基进行搅拌。凝胶培养基可以不含生长因子。凝胶培养基可以以40质量％以下的浓度含有生长因子。凝胶培养基可以不含bFGF。于上述诱导性多能干细胞的制作方法中，可以进行多次启动因子RNA的导入。专利技术的效果根据本专利技术，可提供适合临床应用的安全的诱导性多能干细胞的有效率的制作方法。附图说明图1是表示第1实施方式的实施例1的结果的荧光显微镜的照片和旁通流量计的点图。图2是表示第1实施方式的实施例1的结果的荧光显微镜的照片和旁通流量计的点图。图3是第1实施方式的实施例3的iPS细胞集落的照片。图4是第1实施方式的实施例3的进行了免疫染色的细胞的照片。图5是第1实施方式的实施例4的进行了免疫染色的细胞的照片。图6是第1实施方式的实施例5的进行了免疫染色的细胞的照片。图7是第1实施方式的实施例6的进行了免疫染色的细胞的照片。图8是表示第1实施方式的实施例7至9的结果的旁通流量计的点图。图9是第1实施方式的实施例10、11的iPS细胞集落的照片。图10是是第1实施方式的实施例10的进行了免疫染色的细胞的照片。图11是是第1实施方式的实施例11的进行了免疫染色的细胞的照片图12是表示第1实施方式的实施例12的每10mL血液中的平均单核细胞数的图表。图13是表示第1实施方式的实施例12的结果的旁通流量计的点图。图14是表示第1实施方式的实施例13的结果的荧光显微镜的照片。图15是表示第1实施方式的实施例13的结果的旁通流量计的点图。图16是第1实施方式的实施例14的iPS细胞集落的照片。图17是表示在第2实施方式的实施例中所使用的启动因子mRNA的Mastermix的成分的表。图18是表示在第2实施方式的实施例中所使用的试剂盒的内容物的表。图19是第2实施方式的实施例的iPS细胞集落的照片。图20是第2实施方式的参考例的荧光显微镜照片。图21是表示第2实施方式的参考例的荧光激活旁通流量计的分析结果的图表。具体实施方式以下，对本专利技术的实施方式加以详细说明。另外，以下所示的实施方式例示了用以体现本专利技术的技术思想的装置或方法，本专利技术的技术思想并不将构成构件的组合等特定为下述内容。本专利技术的技术思想可以在权利要求的范围内加以各种变更。(第1实施方式)第1实施方式的诱导性多能干细胞(iPS细胞)的制作方法包含：准备体细胞的步骤；将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至体细胞的步骤。作为体细胞的例子，可列举：纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导性多能干细胞的制作方法，其包含：准备体细胞的步骤；及将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至所述体细胞的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.02.24 US 62/463,4201.一种诱导性多能干细胞的制作方法，其包含：准备体细胞的步骤；及将含有启动因子RNA的仙台病毒导入至所述体细胞的步骤。2.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，将所述含有启动因子RNA的仙台病毒导入至在凝胶培养基中悬浮培养的所述体细胞。3.根据权利要求1所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，将所述含有启动因子RNA的仙台病毒导入至附着培养的所述体细胞。4.根据权利要求1至3中任一项所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其进一步包含在凝胶培养基中对所述体细胞进行初始化的步骤。5.根据权利要求1至4中任一项所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，所述体细胞为纤维母细胞。6.根据权利要求1至4中任一项所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，所述体细胞为血液细胞。7.根据权利要求6所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其进一步包含使用红血球分离剂，分离单核细胞作为所述体细胞的步骤。8.根据权利要求6所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其进一步包含使用过滤器，分离单核细胞作为所述体细胞的步骤。9.根据权利要求6所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其进一步包含使用免疫磁珠，分离单核细胞作为所述体细胞的步骤。10.根据权利要求1至9中任一项所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，所述启动因子RNA包含M3O或OCT3/4的mRNA、SOX2的mRNA、KLF4的mRNA、及c-MYC的mRNA。11.根据权利要求2或4所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，并不对所述凝胶培养基进行搅拌。12.根据权利要求2或4所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，所述凝胶培养基不含生长因子。13.根据权利要求2或4所述的诱导性多能干细胞的制作方法，其中，所述凝胶培...

【专利技术属性】
技术研发人员：田边刚士，须藤健太，下田英范，布兰登·凯莉，
申请(专利权)人：田边刚士，爱平世股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US