多能干细胞制造系统和生产诱导多能干细胞的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种干细胞制造系统，包括：发送通道(20)，含有细胞的溶液流动通过所述发送通道；装置(30)，所述装置(30)连接到所述发送通道(20)并将多能性诱导物转移到所述细胞中以生产携带所述诱导物的细胞；以及装置(40)，所述装置(40)培养携带所述诱导物的所述细胞以生产由干细胞组成的细胞簇。细胞以生产由干细胞组成的细胞簇。细胞以生产由干细胞组成的细胞簇。

【技术实现步骤摘要】
多能干细胞制造系统和生产诱导多能干细胞的方法
[0001]本申请是向中国国家知识产权局提交的申请日为2016年8月30日的专利技术名称为“多能干细胞制造系统和生产诱导多能干细胞的方法”的第201680050145.X号申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及一种细胞技术，涉及一种多能干细胞制造系统、一种诱导干细胞的方法、一种用于干细胞的漂浮培养方法、一种用于干细胞的漂浮培养容器、一种生产诱导多能干细胞的方法，以及一种从动物细胞生产特定体细胞的方法。

技术介绍

[0003]胚胎干细胞(ES细胞)是从人或小鼠早期胚胎建立的干细胞。ES细胞表现出多能性，这种多能性允许它们分化成它们源自的生物体中的每一种细胞。目前，在细胞移植治疗中利用人ES细胞来治疗许多疾病，包括帕金森病、幼年型糖尿病和白血病。然而，ES细胞的移植存在缺点。值得注意的是，ES细胞的移植可能以类似于不成功的器官移植之后发生的排斥的方式触发免疫排斥。此外，使用通过破坏人胚胎所建立的ES细胞已引起大量基于伦理的批评和强烈的反对。
[0004]在这些情况的背景下，京都大学教授Shinya Yamanaka通过将Oct3/4、Klf4、c
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Myc和Sox2四种基因转移到体细胞中，成功建立了诱导多能干细胞(iPS细胞)。为此，他被授予2012年诺贝尔生理学或医学奖(参见例如专利文献1)。iPS细胞是理想的多能细胞类型，因为它们避免了免疫排斥和伦理问题两者。因此，预期iPS细胞将用于细胞移植治疗。
[0005](诱导干细胞的方法、用于干细胞的漂浮培养方法和用于干细胞的漂浮培养容器的
技术介绍
)
[0006]诱导多能干(iPS)细胞具有两种特征性的潜能。首先是生成体内所有体细胞的潜能。其次是半永久增殖的能力。因为iPS细胞表现出这两种潜能，所以通过从个体自身体细胞生产iPS细胞并将这些细胞转化为感兴趣的体细胞，它们将用于移植治疗而无排斥。因此，iPS细胞在再生医学领域具有巨大的前景。
[0007](生产诱导多能干细胞的方法的
技术介绍
)
[0008]诱导多能干(iPS)细胞具有两种特征性的潜能。首先是生成体内所有体细胞的潜能。其次是半永久增殖的能力。因为iPS细胞表现出这两种潜能，所以它们可以用于移植治疗而无排斥。这可以通过从个体自身体细胞生产iPS细胞并将这些细胞转化为感兴趣的体细胞来实现。因此，iPS细胞在再生医学领域具有巨大的前景。
[0009]目前已建立了若干种生产iPS细胞的方法。生产iPS细胞的方法的典型示例包括使用逆转录病毒或慢病毒的方法，以及使用游离型载体的方法。
[0010]将描述使用逆转录病毒或慢病毒的方法。逆转录病毒或慢病毒可感染体细胞，使得编码重编程因子的基因转移到细胞中。另外，逆转录病毒或慢病毒可将重编程因子插入体细胞的基因组中以诱导重编程因子在细胞中的稳定表达。
[0011]然而，依赖于使用逆转录病毒或慢病毒的方法是有问题的。首先，将重编程因子插入到体细胞的基因组损伤了现有基因或启动子，并且因此可触发细胞的肿瘤发生。其次，插入到基因组中的重编程因子可在iPS细胞转化为体细胞之后再活化。因此，用于移植的源自iPS细胞的细胞具有肿瘤发生的风险。事实上，已确认，转移的重编程因子在小鼠模型的体细胞中再活化，并且细胞变成癌性的(参见例如非专利文献1)。
[0012]此外，使用逆转录病毒或慢病毒生产的iPS细胞可能保留残余病毒。当将此类iPS细胞移植给患者时，残余病毒可感染患者。因此，这些iPS细胞不可用于移植。作为参考，由于对X连锁联合免疫缺陷病(X
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SCID)进行基因治疗，其中通过逆转录病毒载体将γc基因转移到造血干细胞中，患者已被告知由于载体的插入导致的LM02基因的激活而罹患白血病(参见例如非专利文献2和3)。
[0013]因此，使用逆转录病毒或慢病毒生产的iPS细胞在临床治疗中的使用是有问题的。
[0014]接下来，将描述使用游离型载体的方法。为了克服使用逆转录病毒或慢病毒的基因转移方法的问题，已经开发了使用游离型载体来生产iPS细胞的方法(参见例如非专利文献4)。游离型载体是质粒。游离型载体与细胞分裂同时复制。与逆转录病毒和慢病毒不同，重编程因子未插入到体细胞的基因中。由于这种特征，游离型载体可实现重编程因子的长期细胞内表达以生成iPS细胞而无需将基因插入到靶向体细胞的脱氧核糖核酸(DNA)中。
[0015]然而，使用游离型载体的方法也是有问题的。首先，将基因转移到细胞中需要电穿孔，这极大地损伤了细胞；甚至在单个电穿孔事件期间，高百分比的细胞受损。其次，电穿孔不可重复进行。另外，决定使用游离型载体的方法的基因转移效率低于基于逆转录病毒/慢病毒的方法的基因转移效率。
[0016]最近的研究已揭示，游离型载体的转移可导致载体DNA的片段插入到目标iPS细胞的基因中。因此，即使当使用游离型载体时，所得iPS细胞很有可能将含有已插入到其基因组中的载体片段。因此，此类iPS细胞的临床应用仍存在争议。
[0017]由于这些原因，使用游离型载体生产的iPS细胞同样难以在临床上使用。
[0018]因为如上所述的使用逆转录病毒或慢病毒的方法和使用游离型载体的方法都是有问题的，所以已提出了使用RNA来生产iPS细胞的方法(参见例如非专利文献6)。然而，尽管已经使用胎儿或新生的成纤维细胞得到成功iPS细胞诱导，但没有关于iPS细胞使用RNA从源自成年人的体细胞的成功诱导的报道。因此，除非可从源自成年人的体细胞生产iPS细胞，否则其临床应用是困难的。
[0019]另外，为了采集生产iPS细胞所必需的成纤维细胞，需要收获1平方厘米的皮肤片。这给皮肤供体带来了很大的负担。切除之后，必须通过扩增培养来建立成纤维细胞培养系。随着这些成纤维细胞在扩增过程中增殖，它们很可能将招致基因组损伤和/或染色体畸变。
[0020](从动物细胞生产特定体细胞的方法的
技术介绍
)
[0021]诱导多能干细胞(iPS细胞)可生成体内的每一种体细胞。因此，可转化为各种类型的体细胞或组织的iPS细胞预期用于细胞移植治疗和药物开发研究。例如，在2014年，从iPS细胞生产的视网膜细胞用于移植治疗。世界各地正在进行许多项目来从iPS细胞生成脑细胞(和各种其他器官的细胞)，以随后用于移植治疗。
[0022]迄今为止，已经开发出将iPS细胞转化为体细胞的各种方法。然而，为了将iPS细胞用于移植治疗，诱导iPS细胞分化的高效方法是非常重要的。具体而言，需要开发诱导iPS细
胞分化成体细胞的仪器，以提高诱导分化的效率和准确性。这种仪器应生产适合移植治疗的功能性体细胞。
[0023]诱导iPS和ES细胞分化成体细胞的常规方法依赖于生长因子、激素和/或小分子的各种组合和浓度来操纵细胞的命运，以试图重述自然发育的过程。然而，体内发生的自然发育难以在体外复制，并且效率较低。另外，在人体内，iPS细胞至人体细胞的诱导分化相比于在小鼠体内需要更长的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产诱导多能干细胞的方法，包括：制备体细胞；以及通过脂质转染法将重编程因子RNA转移到所述体细胞中。2.根据权利要求1所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述体细胞是血细胞。3.根据权利要求2所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述血细胞是单核细胞。4.根据权利要求2所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述血细胞是造血干/祖细胞。5.根据权利要求2至4中任一项所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述血细胞呈CD34阳性。6.根据权利要求2至5中任一项所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述血细胞是在所述细胞呈CD34阳性的条件下分离的血细胞。7.根据权利要求2或3所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述血细胞呈CD3阳性。8.根据权利要求2、3和7中任一项所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述血细胞是在所述细胞呈CD3阳性的条件下分离的血细胞。9.根据权利要求1至8中任一项所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述重编程因子RNA包括Oct3/4mRNA、Sox2 mRNA、Klf4 mRNA和c
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Myc mRNA。10.根据权利要求9所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述重编程因子RNA还包括选自由GLIS1 mRNA、FOXH1 mRNA、L
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MYC mRNA和p53
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dn mRNA组成的组中的至少一种。11.根据权利要求9或10所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中所述重编程因子RNA还包括LIN28A mRNA或LIN28B mRNA。12.根据权利要求1至11中任一项所述的生产诱导多能干细胞的方法，其中siRNA脂质...

【专利技术属性】
技术研发人员：田边刚士，布兰登，
申请(专利权)人：田边刚士，
类型：发明
国别省市：