一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法及其培养基组合技术

本发明专利技术公开了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法及其培养基组合，涉及细胞分化技术领域。该方法特点是利用酸碱度的调节改变细胞命运，包括采用酸性条件来诱导干细胞向心肌方向分化。本发明专利技术详细阐述了该方法的具体操作步骤，并对分化的心肌细胞进行了鉴定和功能分析。为人多能干细胞来源的心肌细胞的产生提供新思路。新思路。新思路。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法及其培养基组合


[0001]本专利技术涉及细胞分化
，具体而言，涉及一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法及其培养基组合。

技术介绍

[0002]人类多能干细胞(hPSCs)可以分化为人体内的所有细胞类型，是研究人类胚胎发育的重要模型系统。通过hPSC分化产生的特定细胞类型在细胞治疗，药物筛选和疾病模型研究中有较广的应用前景。
[0003]心肌细胞具有不可再生性，因此，由hPSC分化产生的心肌细胞为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供了材料。目前常用的小分子抑制剂诱导心肌细胞的方法效率不稳定，并且费用较高，不利于大规模生产。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法及其培养基组合。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]第一方面，本专利技术实施例提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，其包括以下步骤：采用第一分化培养基将干细胞诱导分化至中胚层；使用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化，所述第二分化培养基中添加有6～10mmol/L酸或在诱导分化的过程中添加酸使得酸在第二分化培养基中的终浓度为6～10mmol/L。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的培养基组合，其包括第一分化培养基和第二分化培养基；所述第一分化培养基包括基础分化培养基以及含有1～10μmol/L的WNT通路激活剂的基础分化培养基；所述第二分化培养基为含有6～10mmol/L的酸的基础分化培养基。
[0009]本专利技术具有以下有益效果：
[0010]本申请提供的以酸碱度调节诱导干细胞往心肌细胞方向分化的方法能够为干细胞来源的心肌细胞的产生提供有效可行的新方法，且效率稳定，费用较低，利于大规模生产。由上述得到心肌细胞存活率及纯度较高，应用前景较广，可为心脏疾病的再生修复以及药物筛选提供材料。以酸碱度调控改变细胞命运亦为其它细胞类型的分化提供了新思路，有较广泛的应用前景。
附图说明
[0011]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0012]图1为酸性条件促进H1细胞向心肌分化；其中，A.酸性条件对RNA表达水平的影响；B.盐酸诱导分化后，通过流式细胞术分析TNNT2阳性细胞的比例，并与传统的WNT抑制剂(IWP
‑
2)方法进行比较；以及在WNT抑制剂(IWP
‑
2)方法基础上添加盐酸，与不添加酸的方法进行比较；C.不同浓度的盐酸或乳酸诱导分化后，通过流式细胞术分析TNNT2阳性细胞的比例；
[0013]图2为酸性条件促进H9和NL4 iPSC细胞向心肌分化，通过流式细胞术分析TNNT2阳性细胞的比例；其中，A为H9；B为NL4 iPSC。
具体实施方式
[0014]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0015]经一系列创造性劳动，专利技术人发现，通过酸碱度调节改变细胞命运的方法成本低，且操作简便，成分无毒害。具体地，酸性培养基可诱导产生高纯度的心肌细胞，有利于技术发展与临床应用。本专利技术确认了基于上述构思构建的方法的具体操作步骤，并对分化的心肌细胞进行了鉴定和功能分析，为干细胞来源的心肌细胞的制备提供了新途径。
[0016]本专利技术实施例提供了一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，其包括以下步骤：采用第一分化培养基将干细胞诱导分化至中胚层；使用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化，所述第二分化培养基中添加有6～10mmol/L中任意浓度的酸或在诱导分化的过程中添加酸使得酸在第二分化培养基中的终浓度为6～10mmol/L，酸的终浓度可以为例如6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L和10mmol/L中的任意浓度或任意两项之间的范围。
[0017]需要说明的是，所述第一分化培养基和所述第二分化培养基中的“第一”和“第二”并非是对培养基的个数、组成或种类的限定，而是对于不同培养阶段的区分，第一分化培养基为第一阶段采用的分化培养基，第二分化培养基为第二阶段采用的分化培养基，在没有对其组成进行具体限定的情况下，其可以理解为普通的分化培养基，后续出现的第三分化培养基同此理解。
[0018]所述第二分化培养基中添加有6～10mmol/L酸是指预先在基础分化培养基中添加酸使得酸的终浓度为6～10mmol/L。
[0019]优选地，所述第二分化培养基中可添加终浓度为3～5μmol/L的WNT抑制剂，或在第二分化培养基诱导培养细胞的过程中添加WNT抑制剂使得WNT抑制剂的浓度达到3～5μmol/L中的任意数值，具体可以为3μmol/L、3.5μmol/L、4μmol/L、4.5μmol/L和5μmol/L中的任意一项或任意两项之间的范围。优选地，第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化的时间为3～7天，具体时长可以为3天、4天、5天、6天和7天中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为6天，当为6天时且第一分化培养基的培养时间为第1～2天时，第二分化培养基的培养基时间为第3～8天。在采用第二分化培养基进行培养的期间，可以选择每天更换新的第二分化培养基，或者选择在分化培养基中补充酸，使得第二分化培养基中pH一直维持在6.2～6.9之间。该范围的pH值能使得干细胞行心肌方向分化。
[0020]优选地，当所述方法为在诱导分化的过程中添加酸使得酸在第二分化培养基中的
终浓度为6～10mmol/L时，酸的添加时间为采用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化的第1～6天；
[0021]当所述方法为在第二分化培养基诱导培养细胞的过程中添加WNT抑制剂使得WNT抑制剂的浓度达到3～5μmol/L时，WNT抑制剂地添加时间为采用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化的第1～3天。
[0022]优选地，所述WNT抑制剂为IWP
‑
2，IWR
‑
1和XAV939中的任意一种。
[0023]优选地，当WNT抑制剂为IWP
‑
2时，所述WNT抑制剂在第二分化培养基中的终浓度为3～5μmol/L。
[0024]在优选的实施方式中，所述酸包括：盐酸和乳酸中的至少一种，相对于其他酸而言，这两种酸对于细胞无毒副作用，能够有效地诱导促进细胞向心肌方向分化。
[0025]在优选的实施方式中，所述将干细胞诱导分化至中胚层的步骤包括：采用所述第一分化培养基对细胞密度为60％～80％的人本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：采用第一分化培养基将干细胞诱导分化至中胚层；使用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化，所述第二分化培养基中添加有6～10mmol/L酸或在诱导分化的过程中添加酸使得酸在第二分化培养基中的终浓度为6～10mmol/L。2.根据权利要求1所述的诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述酸包括：盐酸和乳酸中的至少一种；优选地，所述第二分化培养基的pH为6.2～6.9；优选地，所述第二分化培养基由在基础分化培养基中添加所述酸配制获得；优选地，所述第二分化培养基中还添加有WNT抑制剂，或在第二分化培养基诱导培养细胞的过程中添加WNT抑制剂；优选地，所述WNT抑制剂为IWP
‑
2、IWR
‑
1和XAV939中的任意一种；优选地，当WNT抑制剂为IWP
‑
2时，所述WNT抑制剂在第二分化培养基中的终浓度为3～5μmol/L。3.根据权利要求2所述的诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征在于，采用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化的时长为5～7天；优选地，当所述方法为在诱导分化的过程中添加酸使得酸在第二分化培养基中的终浓度为6～10mmol/L时，酸的添加时间为采用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化的第1～6天；当所述方法为在第二分化培养基诱导培养细胞的过程中添加WNT抑制剂时，WNT抑制剂的添加时间为采用第二分化培养基对所述中胚层进行诱导分化的第1～3天。4.根据权利要求2所述的诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述基础分化培养基的成分包括：DMEM/F12、L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸镁、钠硒、转铁蛋白、化学成分明确的脂质浓缩液以及青链霉素中的至少一种；优选地，所述基础分化培养基中，L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸镁的终浓度为50～80mg/L，钠硒的终浓度为10～20μg/L，转铁蛋白的终浓度为1～20mg/L，青链霉素的终浓度为1～20U/mL。5.根据权利要求1～4任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国凯，刘蔚蔚，
申请(专利权)人：澳门大学，
类型：发明
国别省市：