可筛选的肝脏疾病模型和方法技术

技术编号:22334258 阅读:34 留言:0更新日期:2019-10-19 13:03
本发明专利技术涉及用于研究代谢性肝脏疾病和相关治疗性策略和它们的进展以及通过药理学和/或饮食干预用于检测预防性和治疗性策略的平台,其由至少包括肝细胞和肝的星状细胞和至少一种类型的肝的炎症细胞的人工球状微组织以及进一步的培养基和能够建立和刺激代谢性肝脏疾病的不同阶段的试剂组成。

Screening liver disease models and methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】可筛选的肝脏疾病模型和方法
本专利技术涉及3D组织培养领域及其在药物测试中的应用。引言肝纤维化是几乎所有慢性肝损伤的常见结果,慢性肝损伤包括病毒性肝炎(即,乙型肝炎和丙型肝炎)、酒精性或肥胖相关的脂肪性肝炎(即,非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、寄生虫病(即,血吸虫病)、代谢紊乱(即肝豆状核变性)、血色素沉着症和其他贮积症、先天性异常、自身免疫和慢性炎症(即,结节病)和药物毒性等(Puche、Saiman和Friedman,2013)。肝纤维化被世界卫生组织定义为由于新纤维形成而存在过量胶原蛋白。由于静止的肝星状细胞活化成肌成纤维细胞,因此细胞外基质(ECM)产生纤维。目前主要在动物实验中研究肝纤维化,但也使用分离的肝细胞类型来体外研究纤维化。在Liedtke等人的2013的综述中总结了肝纤维化的体内实验模型。简而言之,肝纤维化最常见的动物模型是手术胆管结扎。其他模型使用基因工程动物,比如Mdr2敲除小鼠或显性失活的TGF-βRII小鼠。另一种类型的动物模型通过注射化学物质(例如,四氯化碳、硫代乙酰胺、二甲基亚硝胺)或通过喂食(例如,高脂肪饮食、胆碱缺乏的饮食)诱导肝纤维化。目前用于肝纤维化的体外模型通常使用肝星状细胞系(HSC,例如,hTERT-HSC、LX2)或新鲜分离的人或啮齿动物HSC的2D培养物。这些培养系统的共同限制是由于HSC与2D培养皿的相互作用而让HSC在培养物中激活成肌成纤维细胞。此外,这些模型仅仅是肝脏形态和生理学的不完整表示,这限制了它们在临床前应用中的使用,例如,测定药物引起纤维化的风险。近年来,3D球体培养物的使用已成为获得用于肝脏疾病研究的生物学相关的体外肝脏系统的更适用的形式(vanGrunsven,2017)。然而,目前的技术水平并未描述通过组装四种主要肝细胞类型(即,肝细胞、库普弗细胞、星状细胞和内皮细胞)来重建肝类器官,以及其用于研究人类肝脏疾病的用途,特别但不完全是从健康肝脏到NASH/纤维化的进展。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种具有优良生理行为的肝脏疾病模型。本专利技术的另一个目的是提供一种肝脏疾病模型,该模型适用于研究任何脂肪变性、炎症、纤维化和肝硬化以及各自的治疗策略。本专利技术的另一个目的是提供一种适用于高通量筛选目的的肝脏疾病模型。通过独立权利要求的主题实现这些和其他目的,而从属权利要求以及说明书公开了进一步的优选实施方案。具体实施方式在详细描述本专利技术之前,应理解本专利技术不限于所述装置或组合物的特定组成部分或结构特征,或所述方法的处理步骤,因为这些装置和方法可以变化。也应该理解的是,在本文使用的技术性术语仅仅是为了描述具体实施例的目的,而没有限制目的。在相互不同的从属权利要求中引用的某一特征并不表示这些特征不能组合使用。权利要求书中的任何参考标号不应构成对范围的限制。必须注意,如说明书和所附权利要求中所使用的,单数形式“一”、“一个”和“所述”包含单数和/或复数指示物,除非上下文另有明确说明。此外,在权利要求中,词语“包含”不排除其他元件或步骤。此外,应理解,在给出由数值界定的参数范围的情况下,范围被认为包括这些限制值。还应理解,本文公开的实施方案不应理解为彼此不相关的各个实施方案。与一个实施方案讨论的特征也意味着结合本文所示的其他实施方案公开。在一种情况下,如果没有用一个实施方案公开特定特征,而是用另一个实施方案公开特定特征,本领域技术人员将理解,并不一定意味着所述特征不意味着与所述其他实施方案一起公开。本领域技术人员将理解,本申请的要点还在于为其他实施方案公开所述特征,但是仅为了清楚起见并且将说明书保持在可管理的篇幅内而没有如此做。此外,本文提到的现有技术文献的内容通过引用整合在此。这尤其指的是公开标准或常规方法的现有技术文献。在这种情况下,通过引用并入主要是为了提供足够的满足充分公开的内容,并避免冗长的重复。根据本专利技术的微组织(MT)的一个实施方案,提供了至少包含肝细胞和肝星状细胞以及进一步的至少一种肝炎症细胞的人造球状微组织。如本文所用,术语“肝炎症细胞”是指肝脏中介导炎症或被炎症细胞因子激活的细胞。这些细胞是,例如,恒定天然杀伤细胞(invariantnaturalkillercells)、T淋巴细胞、多形核细胞或CD8淋巴细胞或其混合物,比如外周血单核细胞(PBMC)。Leite等人在2016年已经公开了模拟肝的类器官的微组织。其中描述的类器官由(i)源自HepaRG肝干细胞的肝细胞加上(ii)肝星状细胞(HSC)组成。作者描述了包含这两种细胞类型的类器官在体外测试药物诱导的肝纤维化中的用途。作者声称他们的肝的类器官培养模型是第一个能够检测肝细胞依赖性和化合物诱导的HSC活化的模型,从而代表了向药物诱导的肝纤维化的体外化合物测试迈出的重要一步。但是Leite等人没有公开在他们描述的类器官中使用炎症细胞。根据本专利技术的微组织的一个实施方案,肝的炎症细胞是库普弗细胞。本专利技术的专利技术人已经认识到库普弗细胞(也称为库普弗-Browicz(库普弗-塔德乌什马)细胞)在脂肪肝向脂肪性肝炎的转变以及最终转变成肝纤维化中发挥重要作用(Duarte等人,2015)。他们已经意识到在球状微组织中使用它可以有助于产生用于肝纤维化研究的更好的类器官。库普弗细胞是位于肝脏中的特化巨噬细胞,它们形成单核吞噬细胞系统的一部分。库普弗细胞活化不仅是早期乙醇诱导的肝损伤的原因,在长期酗酒者中常见,而且也是导致炎症反应的非酒精性脂肪性肝脏疾病(NAFLD)的原因,该反应有助于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发展,已被公认为肝纤维化的主要原因。因此,库普弗细胞在NAFLD向NASH和肝纤维化的进展中起重要作用。为了提高人造球状微组织在其作为肝脏NASH/纤维化模型的可用性方面的质量,专利技术人因此首次建议将库普弗细胞也整合入这种模型中。Organovo提供另一种肝脏微组织,且称为“exVive3D肝脏”。这些组织模型使用3D生物打印技术和不同的肝细胞类型创建。得到的组织含有可重复的结构,并用于肝组织特异性毒性标志物评估,作为体外和临床前(非GLP)动物试验的补充。为了生物打印这些微组织,正在制备包含随后形成组织的细胞的生物链。然后通过连续沉积微挤出将生物链以两隔室平面几何形状沉积到标准24孔板的膜上,具有包含每个隔室的边界区域的非实质细胞以及填充每个隔室的实质细胞(参见Nguyen等人,2016)。通过所述3D生物打印工艺获得的组织不具有球状形状-它们更确切地呈圆柱形状,且因此在其生理行为方面具有缺点。球状形状不能用3D生物打印工艺产生,但很大程度上依赖于细胞的自组装,如下所述。由于组织直径低于500μm,球状形状确保细胞接收足够的氧和营养。小尺寸的球状体仅需要少量的珍贵的原代细胞材料,并因此允许从有限量的细胞材料中产生许多球状体。根据本专利技术的微组织的一个实施方案,微组织还包含内皮细胞。内皮细胞充当选择性渗透屏障,以这种方式控制哪些分子从血管进入包括肝细胞在内的周围组织。内皮细胞促进微循环中的氧和小分子进入肝细胞。其他特殊的功能包括清除胶体和大分子、促进肝星状细胞静止和诱导免疫耐受。肝脏内皮细胞可能受到各种毒素、缺血再灌注以及甚至细菌的损害,导致脉管性肝脏疾病如纤维化。优选本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.人工球状微组织,其至少包含肝细胞和肝的星状细胞以及进一步包括至少一种类型的肝的炎症细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.23 GB 1622149.11.人工球状微组织,其至少包含肝细胞和肝的星状细胞以及进一步包括至少一种类型的肝的炎症细胞。2.权利要求1的人工球状微组织,其中所述肝的炎症细胞是库普弗细胞。3.权利要求1或2的人工球状微组织,其中所述微组织进一步包括内皮细胞。4.权利要求1至3中任一项的人工球状微组织,其中所述微组织具有≥30μm和≤500μm的直径。5.权利要求1至4中任一项的人工球状微组织,其中所述微组织总共包含≥500和≤10000个细胞。6.权利要求1至5中任一项的人工球状微组织,其中所述窦内皮细胞形成包围包含其他细胞类型的三维微组织的细胞层。7.前述任一项权利要求的人工球状微组织,其中所述微组织中的细胞是哺乳动物细胞,优选选自以下:·人细胞,·猴细胞,·猪细胞,·犬细胞,和/或·啮齿类细胞。8.前述任一项权利要求的人工球状微组织,其中a)所述微组织包含促活化的星状细胞,和/或b)所述微组织代表基础状态的肝脏模型。9.权利要求8b的人工球状微组织,其中所述微组织进展至选自下列的状态之一:a)胰岛素抗性状态,b)脂肪变性状态,c)炎症状态,d)纤维化状态,e)NASH/纤维化表型、选项1,f)NASH/纤维化表型、选项2。10.制备至少包含肝细胞、肝的星状细胞、肝的炎症细胞以及进一步的内皮细胞的球状微组织的方法,所述方法包括以下步骤:a)产生或提供至少包含肝细胞、肝的星状细胞和肝的炎症细胞的微组织,b)产生或提供包含窦内皮细胞的悬浮液,c)将所述悬浮液分配到包含步骤a)的一个或多个微组织的孔或容器中,以及d)温育所述孔或容器以使窦内皮细胞粘附于微组织。11.权利要求10的方法,其中所述方法的所述微组织在悬滴系统中生长和培养。12.权利要求10的方法,其中所述方法的所述微组织在低粘附孔中生长和培养。13.权利要求10至12中任一项的方法,其中所述方法的至少一些细胞是在加工前解冻的冷冻保存的细胞。14.权利要求10至12中任一项的方法,其中所述方法的至少一些细胞是非冷冻细胞。15.根据权利要求10至14中任一项的方法获得的球状微组织。16.用于肝脏疾病建模的模型平台,所述模型平台包括权利要求1至9以及15中任一项的微组织。17.权利要求16的模型平台,所述模型平台允许选自以下的至少一种:·疾病进展的机制研究,·通过药理学或饮食干预预防疾病进展,和/或·疾病状态的逆转。18.权利要求16至17中任一项的模型平台,其进一步地以由能够建立和重现疾病特定的状态以及代表特定的预防和治疗进入点的基本培养基和试剂组成的测定就绪的形式提供。19.权利要求18的模型平台,其中所述平台还包含质量控制数据和校准数据,所述数据特定于生产批次,并提供关于选自以下的至少一个特征的信息...

【专利技术属性】
技术研发人员:S·梅斯纳J·M·克尔姆R·科斯塔迪诺娃安杰洛娃W·莫里茨
申请(专利权)人:银丝佛若有限公司
类型:发明
国别省市:瑞士,CH

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1