四氢蛇根碱在逆转肿瘤多药耐药方面的应用制造技术

本发明专利技术属于医药技术领域，提供了四氢蛇根碱(ajmalicine)的一种新用途，具体为在抗多药耐药性肿瘤细胞方面的应用。本发明专利技术涉及天然产物四氢蛇根碱可以特异性抑制多药耐药相关的转运蛋白BCRP，具有逆转肿瘤的多药耐药作用。本发明专利技术通过多项分子药理学实验显示四氢蛇根碱具有逆转肿瘤多药耐药的作用，并且其自身对细胞没有明显毒性。可以开发为肿瘤多药耐药逆转剂，用于肿瘤的辅助治疗，特别是BCRP高表达导致的多药耐药肿瘤。

Application of tetrahydroserpentine in reversing multidrug resistance of tumor

【技术实现步骤摘要】
四氢蛇根碱在逆转肿瘤多药耐药方面的应用
本专利技术涉及一种具有逆转肿瘤多药耐药的天然产物四氢蛇根碱。该天然产物能够特异性的抑制药物外排泵BCRP的外排活性，减少细胞毒性药物的外排，增加细胞内的药量，从而增强化疗药对癌细胞的杀伤作用。因此该化合物在对于多药耐药肿瘤的治疗方面有很好的辅助作用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一大类疾病，然而肿瘤的多药耐药是肿效果，瘤患者化疗失败的一个重要原因，肿瘤细胞的耐药性极大地降低了化疗药的效果。多药耐药的发生是肿瘤细胞内部多种因素相互作用的结果，而主要的机制是肿瘤细胞内ABC转运蛋白高表达将药物排出细胞外、减少药物的在细胞内的量、抑制细胞的凋亡、增强药物代谢酶的活性、增强修复损伤的能力等。因此寻找高效低毒的的多药耐药逆转剂来提高肿瘤治疗的效果是非常有必要的。ABC转运蛋白家族是一大类跨膜蛋白，通常有两个跨膜结构域和两个ATP结合结构域组成，主要功能是结合底物分子，水解ATP，导致蛋白结构的改变，从而将药物从细胞内运输到细胞外，降低药物在细胞内的有效浓度不能起到治疗的作用。在ABC大家族中，MRPs蛋白、P-gp蛋白、BCRP蛋白在肿瘤细胞的多药耐药性的形成中起到了重要的作用。P-gp蛋白是第一个被发现以及研究最广泛的ABC转运蛋白，当化疗药物与肿瘤细胞接触时，药物进入细胞后与p-gp结合，ATP水解，p-gp的构像发生变化。从而将药物排出细胞外。MRP1是1992年cole等在人小细胞肺癌H69AR耐药细胞系中发现的一种ABC转运蛋白家族成员，也能够将药物排出细胞的功能，与p-gp在分子结构上具有一定的序列同源性。但是MRP1不能够独立的转运没有修饰的化疗药物，却能够转运与谷胱甘肽结合的药物。BCRP是在1998年发现的ABC转运蛋白大家族的一种与肿瘤耐药相关的蛋白。与多数ABC转运蛋白不同，BCRP需形成二聚体发挥作用。在研究中发现，很多肿瘤细胞中都有BCRP的高表达。面对肿瘤的多药耐药，应用多药耐药逆转剂是解决肿瘤多药耐药的重要手段，目前已经发现大量具有多药耐药逆转活性的化合物。第一代逆转剂主要是通过直接抑制ABC转运蛋白蛋白的外排作用。主要有维拉帕米、环孢菌素A，它们都是通过与药物的竞争性结合在底物的结合位点，达到逆转转运蛋白的外排，由于它们需要较高剂量才能达到良好的效果，然而高剂量对人体产生较大的毒副作用，因此使他们很难在临床上获得应用。第二代逆转剂有右旋维拉帕米、右旋尼古地平、伐司扑达(PSC833)，其中研究最多的就是PSC833,然而PSC833在临床阶段与抗肿瘤药物共同使用时容易引发多种并发症，产生一些难以预测的不良后果。第三代逆转剂是通过利用构效关系和组合化学的方法克服第二代逆转剂的限制性，从而更有效的抑制ABC转运蛋白的功能。很多的天然产物能够表现出具有逆转ABC转运蛋白介导的多药耐药现象。我们的研究通过多项分子药理学实验，发现四氢蛇根碱特异性的抑制BCRP的外排功能，逆转肿瘤的多药耐药，而对其他ABC转运蛋白没有明显影响。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于公开四氢蛇根碱在肿瘤细胞逆转肿瘤多药耐药方面的应用。本专利技术进一步公开四氢蛇根碱能够特异性的抑制BCRP介导的外排功能，增加化疗药在细胞内的积累。本专利技术更进一步公开了四氢蛇根碱对相关基因表达的影响。附图说明:图1四氢蛇根碱结构式；图2四氢蛇根碱对BCRP外排功能的影响；图3四氢蛇根碱对P-gp外排功能的影响；图4四氢蛇根碱对MRPs外排功能的影响；具体实施方式实施例一：细胞毒性试验实验原理：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基)-2H-四唑单钠盐在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜物。颜色的深浅与细胞的毒性正反比，使用酶标仪在450nM波长处测定OD值，间接反映活细胞的数量实验方法：(1)将细胞以密度以密度为2.5X103/孔接种到96孔板，每孔体积为为100μL，设置三个复孔，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24h(2)设计8个合适的药物浓度，加入孔中，空白对照只加100μL的培养基，阴性对照加100μL不加待测药物的细胞悬液。(3)将加完待测药物的96孔板放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养24h。(4)24h后每孔加入10μLcck-8试剂，37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育4h.酶标仪450nm波长下检测吸光值。(5)处理数据细胞存活率＝(实验组吸光值-空白对照吸光值)/(阴性对照吸光值-空白对照吸光值)X100％。实验结果：四氢蛇根碱的细胞毒性很低，在50μM以下对细胞没有毒性。实施例二逆转实验原理：四氢蛇根碱能够增加细胞毒性药物在细胞内的浓度，增强细胞毒性，从而逆转耐药细胞的耐药性。方法：采用实验一的方法对细胞进行铺板，细胞毒性药物与不同浓度的四氢蛇根碱联用。实验结果：通过cck-8检测结果，实验细胞对盐酸阿霉素的IC50为0.41±0.013μM，其耐药细胞对盐酸阿霉素的IC50为1.0027±0.031μM，对盐酸阿霉素的耐药倍数为2.41倍。逆转剂标准品10μMKo143和盐酸阿霉素联用时的，耐药细胞对盐酸阿霉素的IC50为0.37±0.035μM，逆转倍数为2.71倍。5μM的四氢蛇根碱与盐酸阿霉素联用时，耐药细胞对盐酸阿霉素的IC50为0.72±0.13μM，逆转倍数为1.39倍，当浓度达到10μM，耐药细胞对盐酸阿霉素的IC50为0.35±0.089μM，逆转倍数为2.86倍。由此可见，四氢蛇根碱可以增加抗癌药盐酸阿霉素对耐药细胞的毒性，而且工作浓度与其逆转作用呈正相关。通过cck-8检测，实验细胞对盐酸米托蒽醌的IC50为0.043±0.0074μM，其对应的耐药细胞对盐酸米托蒽醌的IC50为0.209±0.0131μM，对盐酸米托蒽醌的耐药倍数为4.87倍。逆转剂标准品10μMKo143和盐酸米托蒽醌联用时的，耐药细胞对盐酸米托蒽醌的IC50为0.080±0.036μM，逆转倍数为2.61倍。5μM的化合物与盐酸米托蒽醌联用时，耐药细胞对盐酸米托蒽醌的IC50为0.096±0.022μM，逆转倍数为2.18倍，10μM与盐酸米托蒽醌联用时，耐药细胞对盐酸米托蒽醌的IC50为0.047±0.025μM，逆转倍数为4.45倍。由此可见，该化合物可以增加抗癌药盐酸米托蒽醌对耐药细胞药物毒性，而且工作浓度与其逆转作用呈正相关。实施例验三对蛋白外排功能的影响原理：药品对蛋白外排功能的影响可以改变相应的荧光染料在细胞内的荧光强度。方法：(1)将Jurkat-tat细胞以密度为1X105/孔转接到离心管，放入37℃，5％CO2恒温培养箱中培养96小时。(2)将逆转剂标准品Verapamil配置成2mM,染料Rhodamine123配制成50ug/ml、逆转剂标准品MK571配置成5mM,染料BCECF-AM配制成200uM、逆转剂标准品Ko143配制成2Mm，染料hoechst-33342配制成50ug/ml。待测样品配制成2.5mM。(3)标准品和待测样品加入后放入37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育15min。15min后加入荧光染料孵育4h。(4)将96孔板从培养箱中拿出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有逆转肿瘤多药耐药活性的天然产物四氢蛇根碱在实体肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用。

【技术特征摘要】
1.具有逆转肿瘤多药耐药活性的天然产物四氢蛇根碱在实体肿瘤多药耐药逆转剂方面的应用。2.具有逆转肿瘤多药耐药活性的天然产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永钢，杨文根，郭晗，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12