一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用。本发明专利技术通过设计多种IgG1恒定区与1G4113的融合表达形式，筛选获得了可在哺乳动物细胞中可溶性表达的融合蛋白形式，仅需要一步纯化便能够获得纯度较高的重组抗体样T细胞抗原受体。将重组抗体样T细胞抗原受体与MMAE小分子偶联制成T细胞抗原受体偶联药物可以用于制成抗肿瘤药物。将重组抗体样T细胞抗原受体与荧光染料分子Cy5偶联可以用于药物的体内定位或肿瘤成像。将重组抗体样T细胞抗原受体与抗CD3抗体偶联制成可溶性表达的双特异性分子，可以用于制成抗肿瘤药物。

A Recombinant Antibody-like T Cell Antigen Receptor, T Cell Antigen Receptor Coupling Drug, Bispecific Molecule and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种重组抗体样T细胞抗原受体、T细胞抗原受体偶联药物、双特异性分子及应用。
技术介绍
癌症已经成为危害人类健康的重要疾病。近年来，以肿瘤免疫检查点抑制剂、过继性免疫细胞治疗和个体化肿瘤疫苗为代表的肿瘤免疫疗法表现出前所未有的抗肿瘤治疗效果，成为癌症研究和临床治疗的热点。肿瘤抗原靶点的选择是肿瘤免疫治疗能否成功的关键因素，肿瘤新抗原由于其肿瘤特异性引起了研究者的广泛关注，成为肿瘤免疫治疗的潜在理想靶点。体细胞突变是肿瘤发生发展的重要驱动因素，在肿瘤细胞中存在大量的点突变、小片段的插入缺失以及基因融合等形成的突变蛋白，其展示到细胞表面可以形成肿瘤特异性抗原(Tumor-SpecificAntigen，TSA)。与肿瘤细胞高表达的肿瘤相关抗原(Tumor-AssociatedAntigen，TAA)不同，TSA仅存在于肿瘤细胞中，可有效区分肿瘤细胞与正常细胞，是理想的药物作用靶点。细胞中的大部分蛋白质位于细胞内，突变的胞内蛋白可经胞内途径处理后成为抗原肽，通过主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)I类分子提呈到细胞表面形成MHC-多肽复合物(pMHC)，成为肿瘤特异的新抗原(Tumor-SpecificNeoantigen)，被TCR(T细胞受体，Tcellreceptor)识别从而介导T细胞免疫应答。目前已有研究发现能够被特异性T细胞所识别的肿瘤特异性新抗原，如非小细胞细胞肺癌中经典的耐药突变EGFRT790M与HLA-A*0201，KRAS中致癌突变G12D与HLA-C*0802，慢性髓性白血病中费城染色体融合基因BCR-ABL新生多肽与HLA-A*0301等突变多肽与MHCI类分子形成的pMHC。抗体药物在抗肿瘤领域发挥着举足轻重的作用。近年来，针对pMHC的抗体(TCR-mimicorTCR-likeAntibody，TCRm)筛选得到研究者的青睐。虽然筛选获得的抗体亲和力(一般在10～100nM)已经处于比较高的水平，但是仍难以达到抗体药物的水平(一般<10nM)，需要进一步改造成熟。在已发表的超过50种的TCRm中，靶向肿瘤新抗原的抗体仅有2例，分别靶向KRAS的G12V突变与HLA-A*0201、EGFR的L858R突变与HLA-A*0301形成的pMHC，且后者特异性并不理想。突变蛋白与正常蛋白形成的pMHC中仅有少量氨基酸残基的改变，抗原肽的氨基酸残基容易被MHC包埋，使得靶向肿瘤新抗原的TCRm抗体筛选的难度和工作量极大，还存在特异性差等缺点。TCR对pMHC的识别具有高度特异性，能够识别肿瘤新抗原的特异性TCR有望成为靶向肿瘤细胞的肿瘤特异性TCR，但TCR在亲和力方面不尽人意(一般在1～100μM)，也是限制TCR作为药物广泛应用的瓶颈。另一方面，TCR是膜蛋白，难以可溶性表达，也限制了TCR作为蛋白类药物的应用并增加了TCR体外活性评价的难度。Jonathan(BOULTERJM,GLICKM,TODOROVPT,etal.Stable,solubleT-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics[J].ProteinEng,2003,16(9):707-711.)等对TRAC的T48C以及TRBC的S57C进行突变改造，在大肠杆菌中表达，并通过复性形式成功获得多种可溶性TCR，该方法虽然适用于多种可溶性TCR的制备，但是存在以下问题：1、复性效率低(≈40％)；2、大肠杆菌存在内毒素等毒性物质难以去除干净，且对人体有危害；3、该方法包括大肠杆菌包涵体表达、纯化，复性以及复性后再由离子交换柱和分子筛纯化，过程非常繁琐，技术要求高；4、获得产品的纯度约95％，仍需进一步提高才能满足后续成药等。因此，目前TCR作为药物分子的应用受到限制。探索安全有效的、适用于不同TCR的可溶性表达方法是TCR走向蛋白药物的前提。
技术实现思路
本专利技术提供了一种使用哺乳动物细胞表达且为可溶性表达的重组抗体样T细胞抗原受体。一种重组抗体样T细胞抗原受体，为异源二聚体，第一亚基包括依次连接的ECDα-铰链区-CH2-CH3，第二亚基包括依次连接的ECDβ-铰链区-CH2-CH3，其中，ECDα和ECDβ分别为T细胞抗原受体1G4113的α链和β链的胞外结构域，铰链区、CH2、CH3均为IgG1的结构，并且第一亚基和第二亚基的两个CH3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。优选的，所述第一亚基和/或第二亚基的C末端还连接有连接臂LPETG。sortaseA是从金黄色葡萄球菌中分离的催化转肽反应的酶，其184位的半胱氨酸亲核攻击LPXTG(X表示天然氨基酸中任意一种)标签中苏氨酸(T)和甘氨酸(G)之间的肽键，形成共价硫代中间体，同时释放出甘氨酸及其羧基末端肽段。该中间体通过捕获溶剂中的甘氨酸底物从而在苏氨酸和捕获的甘氨酸底物之间形成新的肽键，释放出sortaseA酶进行下一步催化。由于该反应特异性高、操作简单、反应条件温和，sortaseA已被广泛用于蛋白质工程和蛋白质定点修饰。更优选的，所述第一亚基的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示；所述第二亚基的氨基酸序列如SEQIDNo.13所示。最优选的，所述第一亚基的编码基因序列如SEQIDNo.8所示；所述第二亚基的编码基因序列如SEQIDNo.9所示。本专利技术重组抗体样T细胞抗原受体的制备方法包括以下步骤：(1)将第一亚基的编码基因和第二亚基的编码基因分别克隆到表达载体中获得两个表达质粒；(2)将两个表达质粒共同转染哺乳动物细胞中进行表达；(3)使用ProteinA填料进行柱层析纯化获得所述重组抗体样T细胞抗原受体。其中，使用的表达载体为pMH3质粒，表达用的哺乳动物细胞为293F细胞。本专利技术又提供了所述重组抗体样T细胞抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术又提供了一种T细胞抗原受体偶联药物，在所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端通过sortaseA酶催化转肽反应偶联上vcMMAE，其中vc为缬氨酸-瓜氨酸二肽接头，MMAE为海兔毒素。缬氨酸-瓜氨酸二肽接头可在溶酶体酶cathepsinB作用下断开。本专利技术又提供了所述的T细胞抗原受体偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术又提供了一种T细胞抗原受体偶联药物，在所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端偶联上荧光分子Cy5，所述T细胞抗原受体偶联药物的制备方法包括以下步骤：(1)提供第一亚基和/或第二亚基C末端连接有连接臂LPETG的重组抗体样T细胞抗原受体，通过sortaseA酶催化转肽反应与GGG-(PEG)3-N3偶联获得C末端连接有N3接头的重组抗体样T细胞抗原受体；(2)提供Cy5-DBCO，将步骤(1)C末端连接有N3接头的重组抗体样T细胞抗原受体与Cy5-DBCO通过N3接头与DBCO接头发生环加成反应，制得所述T细胞抗原受体偶联药物。由于在所述重组抗体样T细胞抗原受体上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，为异源二聚体，第一亚基包括依次连接的ECDα‑铰链区‑CH2‑CH3，第二亚基包括依次连接的ECDβ‑铰链区‑CH2‑CH3，其中，ECDα和ECDβ分别为T细胞抗原受体1G4113的α链和β链的胞外结构域，铰链区、CH2、CH3均为IgG1的结构，并且第一亚基和第二亚基的两个CH3之间分别使用knob‑into‑hole技术设计成knob结构和hole结构。

【技术特征摘要】
1.一种重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，为异源二聚体，第一亚基包括依次连接的ECDα-铰链区-CH2-CH3，第二亚基包括依次连接的ECDβ-铰链区-CH2-CH3，其中，ECDα和ECDβ分别为T细胞抗原受体1G4113的α链和β链的胞外结构域，铰链区、CH2、CH3均为IgG1的结构，并且第一亚基和第二亚基的两个CH3之间分别使用knob-into-hole技术设计成knob结构和hole结构。2.如权利要求1所述的重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，所述第一亚基的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示；所述第二亚基的氨基酸序列如SEQIDNo.13所示。3.如权利要求2所述的重组抗体样T细胞抗原受体，其特征在于，所述第一亚基的编码基因序列如SEQIDNo.8所示；所述第二亚基的编码基因序列如SEQIDNo.9所示。4.如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用。5.一种T细胞抗原受体偶联药物，其特征在于，在如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端通过sortaseA酶催化转肽反应偶联上vcMMAE，其中vc为缬氨酸-瓜氨酸二肽接头，MMAE为海兔毒素。6.如权利要求5所述的T细胞抗原受体偶联药物在制备抗肿瘤药物中的应用。7.一种T细胞抗原受体偶联药物，其特征在于，在如权利要求1～3任一所述重组抗体样T细胞抗原受体的第一亚基和/或第二亚基的C末端偶联上荧光分子Cy5，所述T细胞抗原受体偶联药物的制备方法包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵文彬，刘文慧，沈莹，周展，潘利强，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33