一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途，所述融合蛋白包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种，本发明专利技术的融合蛋白将B7.1、B7.2和SEA至少两种构建成融合蛋白，发挥出叠加放大的效果，其显示的生物活性远远超过单个原料蛋白，诱导并激活T细胞来杀死肿瘤，T细胞可分泌的细胞因子例如肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、颗粒酶并诱导作为靶细胞的癌细胞产生Fas等从而导致癌细胞凋亡，实验证明本发明专利技术的各个融合蛋白对于各种癌症和实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。

An Enhanced Anti-Tumor Fusion Protein and Its Preparation Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种增强型抗肿瘤融合蛋白及制备方法及用途
本专利技术涉及一种融合蛋白及制备方法及用途，特别是涉及一种由诱导并激活T细胞的共刺激分子(Costimulatorymolecules)和能引起抗癌免疫反应的超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素所构建的融合蛋白，公开了它们的结构(蛋白序列)、制备方法以及抗癌的生物活性。
技术介绍
T细胞的有效活化需要两个信号的参与,即需要抗原肽-MHC复合物与T细胞上的TCR-CD3结合提供第1信号，以及共刺激分子(Costimulatorymolecules)介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的B7.1(CD80)、B7.2(CD86)分子与T细胞上表达的相应受体(CD28和CTLA-4)提供(AmjRespirCritCareMed,162,5164-5168,2000；ImmunolCellBiol,77,304-311,1999；ClinCancerRes,13,5271-5279,2007；TrendsImmunol,24,313-318,2003)。B7.1表达在活化的DC、B细胞和单核细胞上，B7.2在B细胞、T细胞、DC和巨噬细胞上呈低水平表达，但B7.2可被诱导快速上调，而B7.1被诱导上调表达时间比B7.2晚。初始T细胞上的CD28与APC上的B7.1/B7.2结合，可以促进IL-2转录，同时使IL-2受体在T细胞上表达增加，从而促进T细胞增殖，还可以通过增加Bcl-xl的表达途径使T细胞免于凋亡。作为药物的应用，B7.1-Fc或B7.2-Fc可以诱导并激活抗癌的T细胞，显示出抗肿瘤的生物活性(CancerRes,59,4964-4972,1999；CancerRes,59,2650-2656,1999；ClinCancerRes,11,8492-8502,2005；JImmunol,172,1347-1354,2004；CancerRes,62,5727-5735,2002)。超抗原(Superantigen)也能引起细胞毒作用，它是一类特殊的抗原分子，主要是一些细菌的毒素和逆转录病毒基因的产物，不需要抗原提呈细胞的加工处理，而以完整的蛋白质形式直接与细胞膜上的MHCII类分子结合形成复合物，识别TCR的Vb片段，激活比普通抗原多得多的T细胞(包括CD4+，CD8+)，并释放大量细胞因子，对靶细胞产生强而有力的细胞毒作用。超抗原与人类多种急、慢性疾病的发生有关，但在抗肿瘤研究中也发挥了独特的作用，尝试用它激活的T细胞来杀伤肿瘤，并取得了一定的成果，目前较有研究基础的超抗原主要是金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C等(TechnolCancerResTreat,16,125-132,2017；BiosciBiotechnolBiochem,81,1741-1746,2017；AnticancerRes,25,3565-3573,2005；BiochemBiophysResCommun,290,1336-1342,2002；CancerImmunolImmunother,33,231-237,1991)。目前，尚未有使用各种诱导或刺激T细胞分子联合用于肿瘤治疗的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种增强型抗肿瘤融合蛋白。本专利技术的第二个目的是提供一种增强型抗肿瘤融合蛋白的制备。本专利技术的第三个目的是提供一种增强型抗肿瘤融合蛋白在制备抗肿瘤药物的用途。本专利技术的技术方案概述如下：一种增强型抗肿瘤融合蛋白，包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1简称B7.1；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2简称B7.2；超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A简称SEA。B7.1的氨基酸序列用SEQIDNo.2所示；所述B7.2的氨基酸序列用SEQIDNo.4所示；所述SEA的氨基酸序列用SEQIDNo.6所示。优选地，B7.1和B7.2融合的融合蛋白、B7.1和SEA融合的融合蛋白、B7.2和SEA融合的融合蛋白、B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白。所述B7.1和B7.2融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQIDNo.8所示；所述B7.1和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQIDNo.10所示；所述B7.2和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQIDNo.12所示；所述B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQIDNo.14所示。重组载体，含有编码权利要求4所述的融合蛋白的核苷酸序列，编码B7.1和B7.2融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQIDNo.7所示；编码B7.1和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQIDNo.9所示；编码B7.2和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQIDNo.11所示或编码B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白的核苷酸序列由SEQIDNo.13所示；一种增强型抗肿瘤融合蛋白衍生物，对融合蛋白进行的点突变、氨基酸序列缺失或增加产生的突变体。一种宿主细胞，含有上述重组载体。一种增强型抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于培养上述宿主细胞，收集表达融合蛋白。上述融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤药物的应用。本专利技术的优点：本专利技术的融合蛋白将B7.1、B7.2和SEA至少两种构建成融合蛋白，发挥出叠加放大的效果，其显示的生物活性远远超过单个原料蛋白，诱导并激活T细胞来杀死肿瘤，T细胞可分泌的细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、颗粒酶并诱导作为靶细胞的癌细胞产生Fas等从而导致癌细胞凋亡，实验证明本专利技术的各个融合蛋白对于各种癌症和实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。附图说明图1表示各种蛋白抑制肿瘤生长，图中横轴表示荷瘤小鼠生长天数，纵轴表示肿瘤体积(cm3)，图中右边曲线编号表示实验用小鼠的编组，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。图2表示第9天杀死荷瘤小鼠解剖后的肿瘤重量，横轴表示的是实验用小鼠的编组，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。图3利用常规免疫组化检测肿瘤组织内的T细胞，棕色小点部分是T细胞，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。图4利用常规免疫组化检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，棕色部分是T细胞分泌的TNF-α，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是B7.2-SEA组，8是B7.1-B7.2-SEA组。图5利用常规免疫组化检测颗粒酶(GranzymeB)，棕色部分是T细胞分泌的颗粒酶，1是生理盐水组，2是B7.1组，3是B7.2组，4是SEA组，5是B7.1-B7.2组，6是B7.1-SEA组，7是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强型抗肿瘤融合蛋白，其特征是包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1简称B7.1；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2简称B7.2；超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A简称SEA。

【技术特征摘要】
1.一种增强型抗肿瘤融合蛋白，其特征是包括诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1、诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A中至少两种；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.1简称B7.1；所述诱导并激活T细胞的共刺激分子B7.2简称B7.2；超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A简称SEA。2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征是所述B7.1的氨基酸序列用SEQIDNo.2所示；所述B7.2的氨基酸序列用SEQIDNo.4所示；所述SEA的氨基酸序列用SEQIDNo.6所示。3.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征是B7.1和B7.2融合的融合蛋白、B7.1和SEA融合的融合蛋白、B7.2和SEA融合的融合蛋白、B7.1、B7.2和SEA融合的融合蛋白。4.根据权利要求3所述融合蛋白，其特征是所述B7.1和B7.2融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQIDNo.8所示；所述B7.1和SEA融合的融合蛋白的氨基酸序列用SEQIDNo.10所示；所述B7.2和...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙嘉琳，
申请(专利权)人：孙嘉琳，
类型：发明
国别省市：上海,31