抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物制造技术

本发明专利技术公开了抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ.ID.NO4所示；内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变。本发明专利技术的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在体内稳定，半衰期长、抗肿瘤生物活性高。

Derivatives of anti-tumor protein endostatin

The invention discloses a derivative of anti-tumor protein endostatin. The amino acid sequence of the endostatin is shown in seq.id.no4; one arg62arg63 of the amino acid sequence of the endostatin has point mutation. The derivative of the anti-tumor protein endostatin of the invention is stable in vivo, has long half-life and high anti-tumor biological activity.

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物本申请是申请号为201510761800.X的分案申请，申请日2015年11月10日，专利技术创造名称：抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物及应用。
本专利技术涉及一种抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物及应用，属于生物医药抗肿瘤药物领域。
技术介绍
肿瘤生长依赖血管的形成，而血管的形成又受到血管生长因子和抑制因子的调节，抑制肿瘤血管的生长是治疗肿瘤的有效方法。内皮抑素(Endostatin)具有抑制血管生成的功能，所以在肿瘤的抗新生血管治疗中受到了重视。内皮抑素是胶原蛋白XVIII的水解而产生的C端184个氨基酸片断，它能有效抑制多种不同种类肿瘤，生物学作用呈广谱性，也无耐药性，是迄今发现的最好的血管生成抑制因子(ExpCellRes,312,594-607,2006)。但是，在猴子实验和人的临床试验中发现内皮抑素的半衰期很短，呈现指数级降解，10小时前后内皮抑素的体内含量递减百倍甚至接近为零(ActaPharmacolSin,26,124-128,2005；JClinOncol,20,3792-3803,2002)，表明它在动物体内很不稳定，这将大大影响内皮抑素的抗肿瘤治疗效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供半衰期长、抗肿瘤生物活性高的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物。本专利技术的第二个目的是提供抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在制备抗癌药物的应用。本专利技术的第三个目的是提供编码上述内皮抑素的衍生物的DNA片断在制备抗肿瘤药物的应用。<br>一种抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ.ID.NO4所示；所述衍生物包括：内皮抑素与抗体IgG不变区连接；或在内皮抑素的N端前面引入Arg；或在内皮抑素的N端前面、或C端后面、或N端前面和C端后面引入糖基化位点的氨基酸短肽；或内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变、或Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变、或Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变的同时Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变。或内皮抑素与抗体IgG不变区连接，在内皮抑素的N端前面引入Arg，在内皮抑素的N端前面、或C端后面、或N端前面和C端后面引入糖基化位点的氨基酸短肽，内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变、或Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变、或Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变的同时Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变。IgG不变区为CH1、CH1CH2或CH1CH2CH3，所述内皮抑素与CH1连接的氨基酸序列为SEQ.ID.NO8；所述内皮抑素与CH1CH2连接的氨基酸序列为SEQ.ID.NO10；内皮抑素与CH1CH2CH3连接的氨基酸序列为SEQ.ID.NO12。内皮抑素的N端前面引入Arg为在内皮抑素的N端前面连接一个短肽，所述短肽中含有一个以上的Arg。糖基化位点为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X为其它氨基酸。Arg发生点突变为His。抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物的氨基酸序列最好是SEQ.ID.NO20所示。编码权利要求6所述的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物的核酸序列是SEQ.ID.NO19所示。上述抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在制备抗癌药物的应用。编码上述抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物的DNA片断在制备抗癌药物的应用。本专利技术的优点本专利技术的抗肿瘤蛋白内皮抑素衍生物在体内稳定，半衰期长、抗肿瘤生物活性高。附图说明图1是实施例1的前置序列-内皮抑素分别连接抗体IgG不变区CH1、不变区CH1CH2、不变区CH1CH2CH3所构建的融合蛋白的抗肿瘤活性的实验。图中1：生理盐水；2：前置序列-内皮抑素；3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1融合蛋白；4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1CH2融合蛋白；5：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白。图2是实施例1的前置序列-内皮抑素分别连接抗体IgG不变区CH1、不变区CH1CH2、不变区CH1CH2CH3所构建的融合蛋白以及内皮抑素在小鼠体内半衰期的实验。图中样品(从上到下)，●前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白；▲前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1CH2融合蛋白；■前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1融合蛋白；◆前置序列-内皮抑素图3是实施例2的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白中的内皮抑素N端前面短肽中的Arg的点突变的实验。图中：样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白；样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白N端的点突变体1；样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白N端的点突变体2；样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白N端的点突变体3；样品5：生理盐水(对照)。图4是实施例3的引入糖基化位点短肽的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白的抗肿瘤活性的实验。样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQIDNO.12)；样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体1(SEQIDNO.14)；样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQIDNO.16)；样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体3(SEQIDNO.18)图5是实施例3的引入糖基化短肽的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)：●前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体3(SEQIDNO.18)；▲前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQIDNO.16)；■前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体1(SEQIDNO.14)；◆前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQIDNO.12)。图6是实施例4的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQIDNO.15和SEQIDNO.16)在引入的糖基化位点(Asn210-Ser211-Thr212)上再进行点突变的各种点突变体的抗肿瘤活性的实验。样品1：点突变体Asn210-Ser211-Thr212；样品2：点突变体Asn210-Ala211-Thr212；样品3：点突变体Asn210-Tyr211-Thr212；样品4：点突变体Asn210-Ser211-Ser212；样品5：点突变体Asn210-Ala211-Ser212；样品6：没有引入糖基化位点的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白。图7是实施例4的图6中的各种点突变体融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)x点突变体(Asn210-Tyr21本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ.ID.NO4所示；其特征是内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变。/n

【技术特征摘要】
1.抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ.ID.NO4所示；其特征是内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变。

【专利技术属性】
技术研发人员：孙嘉琳，
申请(专利权)人：孙嘉琳，
类型：发明
国别省市：上海;31