一种泛素链固相检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物样本中蛋白质泛素化修饰的高效、灵敏且无偏性的检测方法。以由两个不同的泛素结合结构域串联而成且N端含有标签蛋白(GST)的人工合成多肽(ThUBD)作为检测试剂。与通用的商业化泛素抗体相比，本发明专利技术提供的检测试剂以及固相检测方法能够高效、无偏性的识别泛素分子形成的8种不同泛素链，实现对生物样本内源泛素链的无偏性检测；可以显著提高泛素化蛋白质的检测灵敏度。

A Solid Phase Detection Method for Ubiquitin Chain and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种泛素链固相检测方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及对泛素链进行检测的方法；本专利技术还涉及串联杂合泛素蛋白结合结构域(ThUBDA)的用途；本专利技术也涉及检测泛素蛋白的试剂盒。
技术介绍
泛素(Ubiquitin)是含有76个氨基酸的小蛋白，因其在真核细胞内广泛存在且高度保守而得名。泛素-蛋白酶体系统(UbiquitinProteasomeSysterm，UPS)是真核生物体内重要的蛋白质特异性降解途径之一。研究表明，除了介导蛋白质的特异性降解之外，泛素化修饰作为重要的调节信号还参与了包括细胞免疫应答、DNA损伤修复和细胞凋亡等几乎所有生命活动。泛素化修饰关键节点的失调与许多疾病的发生发展密切相关，其诸多调控靶点成为疾病治疗的潜在药物靶标。因此，蛋白质泛素化修饰的调控与功能研究是生命科学研究的热点之一。蛋白质的泛素化修饰(Ubiquitination)是一种高度保守且过程可逆的翻译后修饰。在细胞内，泛素经由泛素活化酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的级联酶促反应，通过其C末端的甘氨酸羧基与蛋白质底物的赖氨酸ε-氨基共价连接。泛素本身含有的7个赖氨酸(Lys6，Lys11，Lys27，Lys29，Lys33，Lys48和Lys63)以及泛素分子N端的蛋氨酸可以继续被泛素分子共价修饰，形成8种不同连接方式的多聚泛素链。不同连接方式的泛素链具有不同的空间拓扑结构，可以被不同的蛋白所识别进而介导不同的生物学功能。如最经典的K48链主要介导底物被26S蛋白酶体降解；K63泛素链则主要参与溶酶体的胞内运输、细胞内信号传导和DNA修复等非降解过程；非经典的线性泛素链(M1chain)主要参与NF-κB激酶的激活等过程；K11泛素链引导内质网相关的蛋白质降解和细胞周期调控等过程。由于被修饰蛋白质底物上不同的泛素链具有不同的结构，传导不同的生物学功能，因此，泛素链的研究是生命科学和健康医学研究的热点、重点，但也是难点。泛素化修饰纷繁复杂的结构特征与功能的多样性构成了精密的调控语言，称之为“泛素密码”。如何能够高效灵敏地检测泛素化蛋白上的泛素链信号具有重要的技术和应用需求。泛素链和泛素信号可以被细胞内的泛素化系统识别并传递，进而将修饰底物引导到蛋白酶体降解或者其他细胞器发挥功能。泛素化修饰功能的发挥依赖于信号重要传递者——含有泛素结合结构域(Ubiquitinbindingdomain,UBD)的蛋白质。研究表明在人的蛋白质组中存在250多个包含有UBD的泛素受体蛋白。根据其生化与结构特征可分为16类，包括UBA(Ub-associateddomain)、UIM(Ub-interactingmotif)、PAZ(polyUb-associatedzincfinger)、MIU(motifinteractingwithUb)，CUE(couplingofUbconjugationtoERdegradation)，GAT(Golgi-localized，Gamma-era-containing，Arf-binding)，UBZ(ubiquitin-bindingzincfinger)，UBC(ubiquitin-conjugatingenzyme)，UEV(ubiquitin-conjugatingenzymeE2variant)，UBM(ubiquitinbindingmotif)，NZF(Np14zincfinger)，ZnF-UBP(ubiquitin-specificprocessingproteasezincfinger)，ZnF-A20(zincfinger)，GLUE(GRAM-likeubiquitinbindinginEAP45)，Jab1/MPN(Junkinaseactivationdomainbinding/Mpr1pandPad1pN-terminal)和PFU(PLAAfamilyubiquitinbinding)。UBD种类与结构的多样性决定了其与泛素结合的亲和力的多样性和特异性。不同的UBD结合泛素单体的能力存在很大差异，其解离常数(Kd)从2到750μM不等。许多蛋白质含有重复的UBD序列或形成蛋白质的二聚体，增强了与泛素链的亲和特性。多个UBD三维结构解析结果表明UBD可通过三种方式与泛素分子结合。大多数UBD与泛素分子第44位的异亮氨酸(Ile)为中心的疏水区结合。另外，Rabex-5蛋白中的ZnF-A20结构域则与泛素第58位的天冬氨酸(Asp)结合。UBD与泛素的识别机制决定了UBD与泛素及泛素链的结合能力与特异性。2003年，Peng等利用芽殖酵母内源表达带有组氨酸标签的泛素蛋白，在变性条件下成功富集了酵母细胞中的泛素化蛋白质；相同的策略已被成功地应用到其他类泛素蛋白修饰的蛋白质底物的鉴定。然而该方法存在明显的局限性，经基因改造的泛素基因可用于酵母、细胞甚至转基因动物，但无法应用于临床标本内源蛋白的泛素化研究。利用人工表达泛素结合结构域UBD亲和纯化泛素化蛋白质成为有效的方法。Hjerpe等发现4个串联的UBA泛素结合结构域与泛素链的结合能力明显提高，而且能够保护多聚泛素化修饰，避免其被蛋白酶体降解及去泛素化酶的作用。Hikaru等改造Ub-ProT并结合酶切技术实现对泛素链长度与种类的分析。Shi等利用4个串联的UBA泛素结合结构域成功地从哺乳动物细胞中富集到许多原先未鉴定到的泛素化蛋白质。这些报道中均使用了单一的UBA结构域，在大规模泛素化蛋白质富集过程中，会根据所选择的泛素结合结构域的特性对不同泛素链修饰底物进行富集。高媛和李衍常等系统评价了不同UBD对泛素链的亲和能力与结合偏性，选择性组合不同的泛素结合结构域，构建了人工杂种蛋白，发展了高效、无偏性的串联杂合泛素结合结构域(Tandemhybridubiquitinbindingdomain,ThUBD)，实现对细胞或组织样本的内源泛素化蛋白的有效富集。然而，泛素链的有效检测还存在诸多挑战。目前，蛋白质免疫印迹法(即WesternBlot)，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的检测手段，其原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品或生物组织样品中靶标蛋白进行孵育结合，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质的表达情况。目前，生物样品内源的泛素化修饰检测主要依赖于泛素抗体识别泛素的特定序列。由于抗体是通过泛素序列中的抗原表位识别泛素分子，因此抗原表位的充分暴露成为了抗体识别泛素的先决条件。同时，由于不同的泛素链具有不同的空间结构，其中K63和M1链的结构是充分舒展的，K6，K11，K27，K33，K48链的结构是比较紧密的，K29链的空间舒展程度介于K63和K48之间。不同的空间拓扑结构，导致不同类型的泛素链中泛素抗原表位的暴露程度不同，泛素分子的抗原表位被包埋则会低泛素抗体的识别效率，具体表现就是泛素抗体对泛素链的识别存在偏好性。由此造成的问题是利用泛素抗体无法真实的反映样本中泛素化信号的强度。目前，缺乏能够区分开单泛素化修饰和多聚泛素链修饰的检测方法，现有的泛素抗体检测泛素链的灵敏度、无偏性和准确性有待提高。中国专利ZL201410323921.1公开了一种串联杂种泛素蛋白结合结构域(T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测生物样本中蛋白质泛素链修饰的检测方法，其中所述方法以带有通用标签的杂种泛素结合结构域多肽作为检测试剂。

【技术特征摘要】
1.一种检测生物样本中蛋白质泛素链修饰的检测方法，其中所述方法以带有通用标签的杂种泛素结合结构域多肽作为检测试剂。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述检测为将杂种泛素结合结构域多肽作为诱饵蛋白，结合Far-westernblotting技术检测生物样本中蛋白质泛素链修饰。3.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述杂种泛素结合结构域多肽为如下(A)或(B)多肽：(A)由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成；(B)由至少两个相同的或不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成。4.根据权利要求1至3任一项所述的检测方法，其中所述杂种泛素结合结构域多肽1选自：(a)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域；(b)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域；n为大于等于2的整数；(c)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域；和(d)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成；所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成：来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域，以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域；n为大于等于2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李衍常，徐平，肖伟弟，高媛，常蕾，高慧英，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11