一种含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种含有碳氮键His‑Vx3‑eGFP蛋白‑纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用，所述泛素化蛋白是由His‑Vx3‑eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过碳氮双键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。相对于现有技术，本发明专利技术所得α‑Al2O3‑His‑Vx3‑eGFP性质稳定，能够大大提高泛素化蛋白的募集效果，简化了实验操作。此外，还克服了原有泛素化蛋白疫苗使用时添加佐剂的缺陷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法，属于肿瘤疫苗

技术介绍
肿瘤严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或化疗、放疗是目前肿瘤病人首选的治疗方法。临床资料显示，大部分肿瘤病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肿瘤的临床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肿瘤治疗策略，具有特异性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞(DC)为载体的肿瘤疫苗目前已成为肿瘤生物治疗的研究热点。在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于DC的肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研究和临床试验。DC疫苗功能的实现主要取决于两部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原，抗原信息得以充分表达。然而，研究试验中存在许多问题有待解决，包括DC来源、制备过程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数，以及如何更好的募集肿瘤抗原等成为目前关注的热点。pAPC(professionalantigenpressingcell,专职抗原提成细胞)交叉递呈的抗原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础、而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的短寿蛋白(平均半衰期约为10分钟)；另一方面，pAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的长寿蛋白(经自噬途径降解)，两者间可能存在着不对称现象，因此，解决上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信息，诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗所面临的难题。目前认为抗原供者细胞主要有两条蛋白降解途径：泛素-蛋白酶体途径和细胞自噬途径。其中，泛素-蛋白酶体途径主要由蛋白酶体降解处理泛素化短寿蛋白，短寿蛋白主要包括一些错误编码、错误翻译等产生的核糖体废产品，半衰期仅为10分钟。近年来发现，肿瘤细胞MHCI(majorhistocompatibilitycomplexI，主要组织相容性复合体I)类分子直接递呈的抗原肽有80％以上来源于短寿蛋白。泛素分子作为胞内信号分子能以一种极其严密的方式标记蛋白分子。泛素分子与靶蛋白或者另一个泛素分子偶联的过程是由一系列分子调控完成的，这些分子有泛素活化酶(E1)，泛素交联酶(E2)和泛素连接酶(E3)；最终使泛素分子偶联到多肽链Lys残基的ε-氨基或者末端氨基酸的最末端基团，随后，另一个泛素分子会通过与前一个泛素分子的Lys48连接而形成泛素链。这种连接类型的泛素链在很大程度上是作为蛋白酶体识别的标志。被泛素化的底物进入蛋白酶体后很快就被蛋白酶体所降解。前期我们通过将一个人工构建的泛素化蛋白结合蛋白(His-Vx3-eGFP)的基因序列导入大肠杆菌(DH5α)并诱导其表达，采用镍离子层析的方法已得到泛素化蛋白并且具有显著的抗肿瘤效果。目前，现有技术中虽然已经有泛素化蛋白的研究，但是，仍存在以下问题需要解决，如将His-Vx3-eGFP偶联纳米铝的反应温度较高(90℃)，该反应温度难以有效控制；偶联后产物的证明方法复杂，需用共聚焦显微镜证明其偶联效果；募集肿瘤细胞泛素化蛋白的能力有待进一步提高。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过碳氮双键(C＝N)形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。本专利技术还提供了所述含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白的提取方法，包括以下步骤：(1)利用三乙氧基硅烷，对纳米铝颗粒进行修饰；(2)将修饰后的纳米铝与戊二醛反应，使醛基连接至纳米铝，然后加入His-Vx3-eGFP蛋白，通过生成碳氮双键形成His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联物；(3)培养肿瘤细胞，抑制泛素化蛋白的降解，经细胞裂解液处理，离心得上清液；(4)将步骤(2)所得共价偶联物和步骤(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub。作为优选，步骤(1)中所述修饰方法为：纳米铝与过量的三乙氧基硅烷室温下搅拌反应，使三乙氧基硅烷与纳米铝上的羟基反应。所述纳米铝在制作过程中与水发生反应使得纳米铝表面具有羟基。作为另一种优选，步骤(2)中所述修饰后的纳米铝与戊二醛反应的条件为：常温搅拌反应2h。作为另一种优选，步骤(2)中所述His-Vx3-eGFP蛋白是由以下方法制得：复苏转化了His-Vx3-eGFP表达质粒的大肠杆菌，诱导其表达蛋白，采用镍离子层析法提取所述His-Vx3-eGFP蛋白。所述His-Vx3-eGFP蛋白为具有泛素结合结构域的Vx3(A7)融合蛋白，Vx3(A7)融合蛋白为串联了三个来源于Vps27(ayeasthomologueofHRS,Hepatocytegrowthfactor-regulatedtyrosinekinasesubstrate)的UIM(ubiquitin-interactingmotif)的人工构建体，是近年来报道的人工构建串联有泛素结合结构域的对泛素化蛋白有很高亲和力的蛋白。作为另一种优选，步骤(3)中所述培养肿瘤细胞为按照常规方法培养；作为另一种优选，步骤(3)中所述抑制泛素化蛋白的降解的方法为：培养的肿瘤细胞生长至80％，加入万珂和氯化铵，加入量分别为(160-240)nmol/L和(25-35)mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解。作为另一种优选，步骤(4)中所述共孵育为4℃共孵育过夜。具体地，本专利技术所述His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，主要是由以下步骤提取所得：(1)纳米铝颗粒的修饰：(1a)称取干燥的纳米铝(α-Al2O3)400mg，置于50ml平底试管中，加入1329.39mg三乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有碳氮键的His‑Vx3‑eGFP蛋白‑纳米铝共价偶联泛素化蛋白，其特征在于，所述泛素化蛋白是由His‑Vx3‑eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过碳氮双键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，其特征在于，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过碳氮双键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白。
2.权利要求1所述的含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用三乙氧基硅烷，对纳米铝颗粒进行修饰；
(2)将修饰后的纳米铝与戊二醛反应，使醛基连接至纳米铝，然后加入His-Vx3-eGFP蛋白，通过生成碳氮双键形成His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联物；
(3)培养肿瘤细胞，抑制泛素化蛋白的降解，经细胞裂解液处理，离心得上清液；
(4)将步骤(2)所得共价偶联物和步骤(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al2O3-His-Vx3-eGFP-Ub。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述修饰方法为：纳米铝与过量的三乙氧基硅烷室温下搅拌反应，使三乙氧基硅烷与纳米铝上的羟基反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立新，沈艳飞，赵金金，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32