一种新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽及应用制造技术

一种新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽及其应用，将新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽或含有新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽的药物组合物用于制备抗菌药物；所述的抗菌肽是从新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis的蜘蛛毒液中分离出来的活性多肽毒素，包含21个氨基酸残基，分子量为2418.647Da，等电点10.48，氨基酸序列为：Val Trp Leu Ser Ala Leu Lys Phe Ile Gly Lys His Leu Ala Lys His Gln Leu Ser Lys Leu。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学中的多肽药物
，具体涉及一种从新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis蜘蛛毒液获得的抗菌肽在抗菌药物中的应用。
技术介绍
在临床使用的多种抗生素的抗菌耐性已经对世界上的公共卫生产生了严重威胁。因此开发一种新型的抗生素来克服细菌的耐药性成为了一个亟待解决的难题。而在开发新型抗耐药菌的抗生素方面，抗菌肽(AMPs)表现出的广谱抗菌活性一度被认为是一个强有力的新型武器用来对抗日益增长而又对传统的抗生素产生抗性的病原体。因此，获得具强抗菌活性的抗菌肽是非常值得追求的目标。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在于提供一种具抗菌作用的多肽lycosin-II及其在制备抗菌药物中的应用。上述专利技术目的是通过以下技术方案实现的:本专利技术提供的抗菌肽包含21个氨基酸残基，氨基酸序列为：ValTrpLeuSerAlaLeuLysPheIleGlyLysHisLeuAlaLysHisGlnLeuSerLysLeu。所述的抗菌肽的分子量为2418.647Da(M+H+)，等电点10.48。将所述的新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis抗菌肽或含有新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis抗菌肽的药物组合物用于制备抗菌药物。Lycosasingoriensis抗菌肽来自于新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis的蜘蛛粗毒，通过分离纯化而得到的一种具有21个氨基酸残基的多肽，命名为lycosin-II。抗菌肽lycosin-II具有很强的抗菌活性，另外，还具有一定的耐盐性和较低的人红细胞毒性，可作为现有的抗生素的替代药物或辅助药物。可有效解决日益严重的抗药性问题及顽固感染对广大患者造成的痛苦。可以用作人类药物和/或牲畜药物、兽用药物或者作为农业、食品及工业上有效的化合物试剂。Lycosasingoriensis蜘蛛毒素抗菌肽lycosin-II的分离纯化方法(1)lycosin-II的分离纯化将新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis的10mg的粗毒干粉用10ml双蒸水溶解后，3000转/分钟离心五分钟，取上清液进行用C18RP-HPLC进行分离纯化(图1A)(美国Waters公司,AllianceHPLC&Millennium高效液相色谱工作站，2690溶剂输送系统，996PDA检测器，分离柱：反相柱，Vydac,C18,4.6mm×250mm；洗脱液分别为：A液(0.1％TFA/H2O)、B液(0.1％TFA/ACN)；洗脱梯度，0-60min,0-60％B液；流速，1ml/min；温度，40℃)，在215nm下监测多肽的洗脱，收集星号洗脱峰，冻干，并用质谱测定其分子量。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定其分子量为2418.647Da(M+H+)(图1B)。使用自动Edman降解得出它的氨基酸序列为ValTrpLeuSerAlaLeuLysPheIleGlyLysHisLeuAlaLysHisGlnLeuSerLysLeu，是一个无半胱氨酸残基的线性多肽。lycosin-II的cDNA序列表明其氨基酸残基“GK”在c-末端这意味着在转运后加工的过程其c-末端发生了酰胺化修饰。(2)lycosin-II的化学合成及纯化Lycosin-II的合成用的是Fmoc/叔丁基策略和HOBt/TBTU/NMM偶联的方法在多肽自动合成仪上合成。图1C为化学合成Lycosin-II的RP-HPLC纯化图谱，质谱结果显示其与天然粗毒分离的Lycosin-II具相同分子量。进一步抗菌实验显示化学合同的Lycosin-II与天然Lycosin-II具同样的抗菌作用。图1D展示了Lycosin-IIα-螺旋的二级结构的构型，lycosin-II的α-螺旋环状结构图表明其形成的是一个双亲性阳离子α-螺旋。这样的结构特征一定程度上可以预测lycosin-II是通过和细菌的细胞膜相互作用来行使其抗菌活性。该多肽的物理化学性质为：纯化冻干粉为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。附图说明图1lycosin-II的纯化及表征；图1A.lycosin-II的RP-HPLC纯化图谱(星号标记峰为lycosin-II峰)；图1B.lycosin-II的MALDI-TOFMS鉴定图谱；图1C.化学合成lycosin-II的RP-HPLC纯化图谱；图1D.lycosin-II的α-helical环形图谱。图2是lycosin-II的抗菌效应；图2A.lycosin-II对三种菌株的剂量依赖性效应。图2B.lycosin-II对三种菌株的时间依赖抑制效应。图3Mg2+存在的条件下，lycosin-II对A.baumannii.菌株的抗菌活性。图4lycosin-II对人类红细胞的溶血效应。具体实施方式为了揭示lycosin-II的抗菌作用，我们检测了lycosin-II对不同菌株的抑制特性，并对lycosin-II的溶血活性进行了分析。实验的开展都是严格的根据临床和标准化研究所标准进行。1.主要材料和仪器化学合成的相关试剂在吉尔生化(上海)有限公司购买，其余生化试剂购自sigma公司。实验所用的测试菌都是在2014年1月到7月从湘雅二医院的临床病人中收集。E.coli,k.pneumonia,S.pyogenes,S.saprophyticus,S.epidermidis,P.aeruginosaandV.Streptococci是从病人腹水中收集。A.baumanniiandS.aureus是从病人唾液中收集。实验仪器主要有美国Waters公司的高效液相色谱仪器(HPLC)及Bruker高性能串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)。2.实验方法和结果2.1lycosin-II的抗菌活性lycosin-II的抗菌活性由医院病人的腹水中所分离得到的临床细菌株以及对这些病菌的抗性所决定。进行实验的病菌都是从ICU中严重患者中分离而来，这些病菌被认为是多抗药性菌株。如图2A所示，lycosin-II对Escherichiacoli,Staphylococcusepidermidis和Acinetobacterbaumannii三种菌株表现出明显的抑制效果，这种抑制效果并且具剂量依赖性，在3.1-12.5μM中，lycosin-II可以完全抑制这3中病菌的生长；lycosin-II对病菌的MIC值用微稀释实验测定(表1)，表1显示Lycosin-II能够抑制所有细菌菌株的生长，对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新疆穴居狼蛛Lycosa singoriensis抗菌肽；所述的抗菌肽包含21个氨基酸残基，氨基酸序列为：Val Trp Leu Ser Ala Leu Lys Phe Ile Gly Lys His Leu Ala Lys His Gln Leu Ser Lys Leu。

【技术特征摘要】
1.一种新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis抗菌肽；所述的抗菌肽包含21个氨基酸残
基，氨基酸序列为：
ValTrpLeuSerAlaLeuLysPheIleGlyLysHisLeuAlaLysHisGlnLeu
SerLysLeu。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽，所述的抗菌肽分子量为2418.647Da，等电点10.48。
3.根据权利要求1或2所述的抗菌肽，所述的抗菌肽是从新疆穴居狼蛛Lycosa
singoriensis的蜘蛛毒液中分离出来的活性多肽毒素。
4.一种新疆穴居狼蛛Lycosasingoriensis抗菌肽在制备抗菌药物中的应用，...

【专利技术属性】
技术研发人员：施小六，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43