本发明专利技术提供一种稳定的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1与R2，其中试剂R1由缓冲液，表面活性剂，保护剂，抗氧化剂，乙二胺四乙酸二钠，三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐，S‑腺苷甲硫氨酸，α‑酮戊二酸，还原型辅酶和防腐剂组成，试剂R2由缓冲液，表面活性剂，保护剂，S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶，Hcy甲基转移酶，腺苷脱氨酶，谷氨酸脱氢酶和防腐剂组成。本发明专利技术提供的试剂盒由于表面活性剂和保护剂、抗氧化剂的协同作用，使其相较市售HCY试剂盒，具有精密度好、灵敏度高、线性范围宽和稳定性好等优点，为临床HCY相关疾病的辅助诊断提供重要依据。
A Stable Cyclic Enzyme Kit for Homocysteine Detection
【技术实现步骤摘要】
一种稳定的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒
本专利技术涉及生化诊断试剂制备领域，具体地说，涉及一种稳定的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒。
技术介绍
同型半胱氨酸(HCY)又称高半胱氨酸，是一种含巯基的氨基酸，属于蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的重要中间产物。HCY在人体血浆中以两种形式存在，氧化型同型半胱氨酸和还原型同型半胱氨酸。还原型同型半胱氨酸中游离的巯基具有很高的活性，其容易被氧化而形成二硫化物形式；氧化型是同型半胱氨酸在血浆中的主要存在形式，以二硫化物形式或与蛋白质结合形式存在。正常情况下，血液中同型半胱氨酸在体内能被分解代谢，浓度维持在较低水平。但在原发性和继发性疾病的影响下，导致血同型半胱氨酸浓度升高，高浓度的HCY可使氧化自由基大量产生引起内皮细胞损伤，使脂质过氧化和氧化型的低密度增加，从而造成血管的损伤和破坏，破损的血管壁增多引起斑块，导致心血管、动脉粥样硬化和中风等疾病。大量研究表明，高同型半胱氨酸血症在动脉粥样硬化和血栓性疾病如脑血管疾病、冠心病和静脉血栓等发病机制中起重要作用。同型半胱氨酸的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC法)、气相色谱-质谱法(GC-MS法)、酶免疫检测法(ELA法)、荧光偏振免疫检测法(FPLA法)和循环酶法。色谱法具有很高的准确度和稳定性，然而，对标本的处理和操作人员、设备维护要求较高，通常作为同型半胱氨酸的参考方法，而不能用于常规样本的检测；酶联免疫法的灵敏度高、特异性强，但是操作繁琐，精密度差，耗费时间长，不适合大量样本的检测；荧光偏振免疫检测法，需要配备专用的检测仪器，单次检测成本较高；循环酶法可用于大型生化分析仪，操作简便，精密度好，目前适合临床检测。目前循环酶法包括水解酶法和胱硫醚法两种方法。胱硫醚法因不能消除正常代谢的β-胱硫醚，尤其对于肾脏疾病患者会产生特别高的β-胱硫醚，从而导致检测结果的不准确。水解酶法，特异性高，抗干扰能力强，能消除体内代谢β-胱硫醚，检测结果更为准确。市场上水解酶试剂多为国外公司垄断，造成高昂的检测成本，因此，亟需开发一种抗干扰能力强，准确度高，成本低廉的HCY检测试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稳定的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供稳定的同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1与R2，为生化分析仪上使用的液体双试剂；所述试剂R1的配方为：20-200mM、pH7.5～9.5的缓冲液，表面活性剂0.5-5g/L，保护剂0.5-20g/L，抗氧化剂0.05-50mM，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)0.2-20mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)0.2-10mM，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)0.05-5mM，α-酮戊二酸(α-KG)1-20mM，NADH(还原型辅酶I)0.1-10mM，防腐剂0.5-2g/L；所述试剂R2的配方为：20-200mM、pH7.5～9.5的缓冲液，表面活性剂0.5-20g/L，保护剂0.5-5g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)1-10KU/L，Hcy甲基转移酶(HMTase)2-20KU/L，腺苷脱氨酶(ADA)1-10KU/L，谷氨酸脱氢酶(GLDH)1-20KU/L，防腐剂0.5-2g/L；其中，所述缓冲液选自硼酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、CAPSO-Na缓冲液、PBS缓冲液等中的至少一种。所述表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、TX-10、ON-870、F68、Brij35、十六烷基氯化铵等中的至少一种。所述保护剂选自BSA、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露醇等中的至少一种。所述抗氧化剂选自抗坏血酸、叔丁基对苯二酚、硫代二丙酸、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯等中的至少一种。所述防腐剂为NaN3和/或Proclin-300。本专利技术的检测试剂盒还包括HCY校准品溶液，所述HCY校准品溶液的浓度分别为2μM、8μM、15μM、30μM、60μM；用于配制所述HCY校准品溶液的试剂为含10g/LBSA和1g/LProclin-300的50mMPBS缓冲液。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒由试剂R1、R2和HCY校准品溶液组成；所述试剂R1的配方为：50mM、pH8.5的Tris缓冲液，TritonX-1001g/L，甘露醇5g/L，叔丁基对苯二酚1mM，乙二胺四乙酸二钠0.5mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐2mM，S-腺苷甲硫氨酸1mM，α-酮戊二酸5mM，NADH0.4mM，NaN31g/L；所述试剂R2的配方为：50mM、pH9.0的HEPES缓冲液，TritonX-1001g/L，甘露醇5g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶3KU/L，Hcy甲基转移酶5KU/L，腺苷脱氨酶2KU/L，谷氨酸脱氢酶10KU/L，NaN31g/L；浓度分别为2μM、8μM、15μM、30μM、60μM的HCY校准品溶液。本专利技术的检测试剂盒可以按照如下方法制备得到：配制试剂R1：按比例称量各组分，先配制20-200mM缓冲液，搅拌溶解，调节溶液pH值为7.5～9.5，再依次加入表面活性剂，保护剂，抗氧化剂，乙二胺四乙酸二钠，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，S-腺苷甲硫氨酸，α-酮戊二酸，还原型辅酶I和防腐剂，混匀，搅拌溶解后，用纯化水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，混匀后，于2℃～8℃储存；配制试剂R2：按比例称量各组分，先配制20-200mM缓冲液，搅拌溶解，调节溶液pH值为7.5～9.5，再依次加入表面活性剂，保护剂，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，Hcy甲基转移酶，腺苷脱氨酶，谷氨酸脱氢酶和防腐剂，混匀，搅拌溶解后，用纯化水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，混匀后，于2℃～8℃储存；配制校准品溶液：先配制含10g/LBSA和1g/LProclin-300的50mMPBS缓冲液，以其为试剂配制浓度分别为2μM、8μM、15μM、30μM、60μM的HCY校准品溶液。将上述制备获得的试剂，按照R160mL/瓶和试剂R220mL/瓶的比例进行分装；HCY校准品溶液按照1mL/支进行分装，再将分装后的试剂和校准品贴标装盒，即为同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒。本专利技术检测试剂盒的检测原理如下：样本在三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)的作用下，氧化型同型半胱氨酸被转化为游离型Hcy，游离型Hcy与S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在Hcy甲基转移酶(HMTase)的催化下反应生成蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)。SAH被S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应(同型半胱氨酸的量被循环放大)，从而放大了检测信号。同时进一步偶联NADH的脱氢反应。产物腺苷旋即被水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶(GLDH)的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的Hcy含量与NADH的变化成正比。在340nm波长下，通过与同样处理的校准品对照，测定出样品中HCY的含量。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术提供的同型半胱氨酸检测试剂盒，检测快速、线性范围本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种稳定的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂R1与R2；所述试剂R1的配方为：20‑200mM、pH7.5～9.5的缓冲液，表面活性剂0.5‑5g/L，保护剂0.5‑20g/L，抗氧化剂0.05‑50mM，乙二胺四乙酸二钠0.2‑20mM，三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐0.2‑10mM，S‑腺苷甲硫氨酸0.05‑5mM，α‑酮戊二酸1‑20mM，NADH 0.1‑10mM，防腐剂0.5‑2g/L；所述试剂R2的配方为：20‑200mM、pH7.5～9.5的缓冲液，表面活性剂0.5‑20g/L，保护剂0.5‑5g/L，S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶1‑10KU/L，Hcy甲基转移酶2‑20KU/L，腺苷脱氨酶1‑10KU/L，谷氨酸脱氢酶1‑20KU/L，防腐剂0.5‑2g/L；其中，所述缓冲液选自硼酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、CAPSO‑Na缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。
【技术特征摘要】
1.一种稳定的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂R1与R2；所述试剂R1的配方为：20-200mM、pH7.5～9.5的缓冲液，表面活性剂0.5-5g/L，保护剂0.5-20g/L，抗氧化剂0.05-50mM，乙二胺四乙酸二钠0.2-20mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐0.2-10mM，S-腺苷甲硫氨酸0.05-5mM，α-酮戊二酸1-20mM，NADH0.1-10mM，防腐剂0.5-2g/L；所述试剂R2的配方为：20-200mM、pH7.5～9.5的缓冲液，表面活性剂0.5-20g/L，保护剂0.5-5g/L，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶1-10KU/L，Hcy甲基转移酶2-20KU/L，腺苷脱氨酶1-10KU/L，谷氨酸脱氢酶1-20KU/L，防腐剂0.5-2g/L；其中，所述缓冲液选自硼酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、CAPSO-Na缓冲液、PBS缓冲液中的至少一种。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、TX-10、ON-870、F68、Brij35、十六烷基氯化铵中的至少一种。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述保护剂选自BSA、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露醇中的至少一种。4.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，
申请(专利权)人：中生北控生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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