利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：第一步，培养种子液；第二步，将种子液依次发酵培养和诱导培养，第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。本发明专利技术在培养过程中对发酵培养基进行合理的补料调控，准确将发酵培养基的溶氧浓度控制在预设范围内，实现了菌株的高密度发酵培养，单批次菌体产能为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的得率，其得率可高达11.23mg/g以上，包被TP抗原的纯度提高了18%；经验证本发明专利技术可重复性好，单批次产能高，降低了大规模生产包被TP抗原的成本。

Preparation of TP-coated Antigen by Recombinant Escherichia coli Fermentation

【技术实现步骤摘要】
利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法
本专利技术涉及免疫学检测
，尤其是涉及一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法。
技术介绍
梅毒是由梅毒螺旋体（TreponemaPallidum，即TP）引起的慢性传播疾病，其临床表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒和潜伏梅毒等，人们感染梅毒后的头两年最具有传染性，如孕妇梅毒病期越早，对胎儿感染的机会就越大。因而，早期诊断对临床预防和治疗梅毒具有重大意义。酶联免疫吸附试验（即ELISA）是酶免疫测定技术中应用最广的技术，具有灵敏度高和特异性高等优点而被广泛用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。ELISA包括双抗体夹心法和间接法，双抗体夹心法是临床上诊断梅毒的首选方法。对于双抗体夹心法检测梅毒来说，酶标记抗原质量的好坏是影响诊断结果的关键性因素，抗原的纯度越高，诊断结果就越可靠。传统包被梅毒抗原的制备工艺是将TP表达的菌株直接接种到培养基中培养3～5天，TP表达耗时时间长，在培养过程中菌株死亡较多，单批次菌体产量很低，在制备包被TP抗原时需要多批次培养，不仅增加了成本，还延长了包被TP抗原获取周期，并且最终得到的包被TP抗原纯度较低，使得梅毒检测灵敏度较低，存在误诊。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，该方法通过补料控制发酵培养基的溶氧量及诱导时间，实现了重组大肠杆菌的高密度培养，降低菌株死亡率，将单批次菌体产能提高为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的表达量和得率。为实现上述目的，本专利技术采取下述技术方案：本专利技术所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，包括以下步骤：第一步，挑取重组大肠杆菌菌株接种在LB培养基中培养15～16h，得一级种子；将得到的一级种子接种到LB培养基内扩大培养2～3h，得到二级种子液；第二步，将第一步得到的二级种子液接种到发酵培养基中发酵培养，发酵培养2～3h后，取样检测发酵培养基中重组大肠杆菌菌株的OD600值，当OD600值为5～7时，降温，向发酵培养基内加入诱导剂诱导培养60～72h；其中，在发酵培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥40%；在诱导培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥30%；第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，重悬，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。所述第一步中的重组大肠杆菌表达载体为pGEX4T-3，表达菌株为Arctic。将所述第二步中发酵培养基的溶氧浓度控制在30%及其以上或40%及其以上的方法为：向发酵培养基内按照0.5mL/min的速度补加补料培养基，所述补料培养基的配方为：葡萄糖125g/L、酵母粉50g/L、蛋白胨50g/L、MgSO4·7H2O5g/L，补料培养基的pH为6.8～7.0。所述第二步中的发酵培养温度控制在35～38℃，诱导培养温度控制在15～17℃。所述第二步中的诱导剂IPTG，其浓度为0.4～0.6mmol/L。所述发酵培养基的配方为：蛋白胨20g/L，酵母浸粉12g/L，NaCl10g/L，葡萄糖13.7g/L，KH2PO41.5g/L，K2HPO42.3g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，发酵培养基的pH为7.0～7.2。所述第二步中二级种子液接种量为5%。所述第二步中，发酵培养阶段的发酵培养基溶氧浓度为40%；诱导培养阶段的发酵培养基溶氧浓度为30%。所述第三步中层析分离时层析柱的平衡液为纯化水、0.1mm柠檬酸和pH为7.6的0.2mmNa2HPO4，层析分离液为50mmTris-HCl、10mmGSH和2mmEDTA等的混合液。所述第三步得到的包被TP抗原的分子量为98.5KDa、纯度≥72.16%，得率为11.36mg/g。与传统发酵工艺相比，本专利技术优点在于对种子液依次进行发酵和诱导培养，在培养过程中对发酵培养基进行合理的补料调控，准确将发酵培养基的溶氧浓度控制在预设范围内，实现了菌株的高密度发酵培养，单批次菌体产能为传统工艺的4倍以上，大大提高了包被TP抗原的得率，其得率可高达11.23mg/g以上，包被TP抗原的纯度提高了18%。经验证，本专利技术可重复性好，单批次产能高，降低了大规模生产包被TP抗原的成本。附图说明图1是本专利技术发酵培养基中重组大肠杆菌菌体湿重与诱导时间的关系图。图2是本专利技术重组大肠杆菌菌体在不同诱导时期的电泳图。图3是本专利技术包被TP抗原的电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作更加详细的说明。本专利技术的化学试剂均为市售产品，本专利技术所用的检测仪器均为常规仪器，本专利技术所用的纯化水为用0.25μm滤膜过滤后的纯化水，本专利技术用到的水溶液均采用纯化水配置。实施例1制备大量表达TP抗原的重组大肠杆菌第一步，经对梅毒螺旋体蛋白分析和免疫效果比对，选取膜蛋白TP15、TP17和TP47序列，利用同源克隆技术合成一个全长为2076bp的TP基因，该TP基因序列SEQIDNo:1为：1TGTGTCTCGTGCACAACCGTGTGTCCGCACGCCGGGAAGGCCAAAGCGGAAAAGGTAGAG61TGCGCGTTGAAGGGAGGTATCTTTCGGGGTACGCTACCTGCGGCCGATTGCCCGGGAATC121GATACGACTGTGACGTTCAACGCGGATGGCACTGCGCAAAAGGTAGAGCTTGCCCTTGAG181AAGAAGTCGGCACCTTCTCCTCTTACGTATCGCGGTACGTGGATGGTACGTGAAGACGGA241ATTGTCGAACTCTCGCTTGTGTCCTCGGAGCAATCGAAGGCACCGCACGAGAAAGAGCTG301TACGAGCTGATAGACAGTAACTCCGTTCGCTACATGGGCGCTCCCGGCGCAGGAAAGCCT361TCAAAGGAGATGGCGCCGTTTTACGTGCTCAAAAAAACAAAGAAAGGCTCGTCTCATCAT421GAGACGCACTATGGCTATGCGACGCTAAGCTATGCGGACTACTGGGCCGGGGAGTTGGGG481CAGAGTAGGGACGTGCTTTTGGCGGGTAATGCCGAGGCGGACCGCGCGGGGGATCTCGAC541GCAGGCATGTTCGATGCAGTTTCTCGCGCAACCCACGGGCATGGCGCGTTCCGTCAGCAA601TTTCAGTACGCGGTTGAGGTATTGGGCGAAAAGGTTCTCTCGAAGCAGGAGACCGAAGAC661AGCAGGGGAAGAAAAAAGTGGGAGTACGAGACTGACCCAAGCGTTACTAAGATGGTGCGT721GCCTCTGCGTCATTTCAGGATTTGGGAGAGGACGGGGAGATTAAGTTTGAAGCAGTCGAG781GGTGCAGTAGCGTTGGCGGATCGCGCGAGTTCCTTCATGGTTGACAGCGAGGAATACAAG841ATTACGAACGTAAAGGTTCACGGTATGAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTTCCTCATGAATTA901AAAGGGATTGCAAAGGAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步，挑取重组大肠杆菌菌株接种在LB培养基中培养15～16h，得一级种子；将得到的一级种子接种到LB培养基内扩大培养2～3h，得到二级种子液；第二步，将第一步得到的二级种子液接种到发酵培养基中，发酵培养2～3h后，取样检测发酵培养基中重组大肠杆菌菌株的OD600值，当OD600值为5～7时，降温，向发酵培养基内加入诱导剂诱导培养60～72h；其中，在发酵培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥40%；在诱导培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥30%；第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。

【技术特征摘要】
1.一种利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步，挑取重组大肠杆菌菌株接种在LB培养基中培养15～16h，得一级种子；将得到的一级种子接种到LB培养基内扩大培养2～3h，得到二级种子液；第二步，将第一步得到的二级种子液接种到发酵培养基中，发酵培养2～3h后，取样检测发酵培养基中重组大肠杆菌菌株的OD600值，当OD600值为5～7时，降温，向发酵培养基内加入诱导剂诱导培养60～72h；其中，在发酵培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥40%；在诱导培养阶段，发酵培养基的溶氧浓度≥30%；第三步，诱导培养结束后，收菌，离心分离，洗涤，破菌，过滤，最后层析分离得到纯化的包被TP抗原。2.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第一步中的重组大肠杆菌表达载体为pGEX4T-3，表达菌株为Arctic。3.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：将所述第二步中发酵培养基的溶氧浓度控制在30%或40%以上的方法为：向发酵培养基内按照0.5mL/min的速度补加补料培养基，所述补料培养基的配方为：葡萄糖125g/L、酵母粉50g/L、蛋白胨50g/L、MgSO4·7H2O5g/L，补料培养基的pH为6.8～7.0。4.根据权利要求1所述的利用重组大肠杆菌发酵制备包被TP抗原的方法，其特征在于：所述第二步中的发酵培养温度控...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘梁涛，李新乐，尚朋林，潘芳芳，张玉莉，李艳姣，张文婧，邓娟，李桂林，赵巧辉，付光宇，吴学炜，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41