一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RT‑LAMP‑LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot‑associated virus,AcCRaV)的引物及检测方法；引物包括内引物：FIP和BIP和外引物：F3和B3。检测方法包括以下步骤：S1、提取猕猴桃待检测样品RNA；S2、将提取的猕猴桃待检测样品RNA反转录为cDNA；S3、以猕猴桃待检测样品cDNA为模板，进行等温扩增；S4、利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒。本发明专利技术根据猕猴桃褪绿环斑相关病毒外壳蛋白核苷酸序列设计LAMP引物，实现了对猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测，可以在猕猴桃植株或组培苗中快速鉴定出是否含有该病毒，进而达到检测、监测、预警以及采取针对性措施的目的，减少病害带来的损失。

A Rapid Detection Method for Kiwifruit Chlorotic Ring Spot Related Virus Based on RT-LAMP-LFD

【技术实现步骤摘要】
一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法
本专利技术属于植物病毒检测
，特别涉及一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法。
技术介绍
猕猴桃是全球重要的园艺产品之一，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐。2017年，世界猕猴桃产量已达到403万吨，但病害的侵染会影响猕猴桃的产量和质量，甚至影响猕猴桃产业的健康发展。病毒病是一种潜伏期长、在生产上存在巨大隐患的病害。猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidiachloroticringspotsassociatedvirus,ACRaV)为的欧洲花楸环斑病毒属的负义单链RNA病毒。在自然条件下该病毒可侵染猕猴桃，叶片呈现褪绿斑驳、褪绿环斑和叶脉黄化等症状，对果树的正常生长发育产生一定的影响。同时，我国在湖北，陕西，四川等地区的猕猴桃栽品种中均有检测到该病毒。目前，针对猕猴桃病毒病目前尚无药剂防治，一旦感染将终身携带病毒，因此，病毒对猕猴桃的潜在威胁不容忽视。果树病毒的检测是病毒病害预测、预报及防治的关键环节。目前病毒病的检测技术主要有普通RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)、电子显微镜检测等方法。1、聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)，它是根据靶基因序列设计1对特异的引物，在体外模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列的引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成。在2-3h内即实现对靶基因扩增放大几百万倍。2、实时荧光定量PCR(Real-timefluorescencequantitativePCR)，该方法是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过荧光信号标记跟踪PCR产物，可对靶基因的扩增情况进行实时监测。上述两种技术对仪器设备要求较高，需要能够实现PCR三个基本反应的普通PCR仪器，一般的PCR扩增仪器设备价格都在2-3万不等，定量PCR设备价格更高；同时荧光染料或荧光标记的特异性探针价格昂贵，扩增效果的检测同样需要特定的检测仪器，这些设备价格十分昂贵，且扩增的试剂价格高、反应所需的时间较长。导致检测总成本高，不适用于田间样品的快速检测。3、酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是最常用的病毒血清学检测方法，于20世纪70年代开始应用于植物病毒检测。该技术特异性较强并具有高敏感度，操作简单、准确、快速。ELISA利用抗体和抗原特异性结合的原理作为一个检测系统。该方法的主要制约因素是需要相应的特异抗体，抗体的制作过程较为复杂，特异抗体的准备过程繁琐，耗时耗力，需要花费几个月不等的时间；虽然有些抗体可以商业购买，但是价格昂贵。同时，该病毒为新报道病毒，目前还未商品化的抗体。4、电子显微镜检测是通过电镜了解病毒结构、病毒的侵染、复制等。电镜是判断病毒是否存在最直观的检测方法。其检测结果的准备性依赖于电镜的品质，先进的仪器设备往往价格昂贵。同时，检测人员必须掌握良好的电镜操作技术及病毒学知识。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种方便快捷的用于检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的引物及检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的引物，包括4条引物：内引物：FIP和BIP；外引物：F3和B3，其中FIP和BIP的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记；各引物的序列分别如下：F3：CTTTTGTAAGATCATGCTTCCT，如SEQIDNO.1所示；B3：TCTATTTCTATAGTGAATCGTCTTG，如SEQIDNO.2所述；FIP：FITC-GGTTAGATTGGAATGTCGTAAAGCTACCAGTGAATTTACAATCTCAG，如SEQIDNO.3所示；BIP：Biotin-AACTCATATCCTGGAACAACCATCCAGGACAAATGAGGCTACC，如SEQIDNO.4所示。本专利技术还公开了一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法，包括以下步骤：S1、提取猕猴桃待检测样品RNA；S2、将提取的猕猴桃待检测样品RNA反转录为cDNA；S3、以猕猴桃待检测样品cDNA为模板，配于引物FIP、BIP、F3和B3进行等温扩增；S4、利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒。进一步地，所述步骤S1包括以下子步骤：S11、取猕猴桃样品置于灭菌预冷研钵中，加入液氮后，快速研磨成粉末；S12、将100mg步骤S11得到的猕猴桃样品粉末放入1.5mL离心管中，加入1mL65℃预热的2％的CTAB提取液，震荡混匀，然后放置于65℃的水浴中20min，每隔2min颠倒混匀一次；S13、在4℃环境中，于10000rpm转速下离心5min，将700μL上清液转移至新离心管；S14、加入700μL苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液，剧烈震荡混匀，所述苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；S15、在4℃环境中，于12000rpm转速下离心10min，然后将400μL上清液转移至新离心管；S16、加入400μL的预冷的6mol/L的LiCL溶液，并在-20℃环境中静置1h；S17、在4℃环境中，于12000rpm转速下离心10min，然后静置5min，倒掉上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，并在室温下干燥3～5min；S18、加入50μLDEPC处理水溶解步骤S17得到的产物，然后-20℃保存备用。进一步地，所述步骤S3中，进行等温扩增时，所述扩增反应体系为：3.5μL检测反应缓冲液10xTermoPolBuffer、1.5μL终浓度为6mmol/L的MgSO4、2.5μL终浓度为1mmol/L的dNTPMIX、2μL终浓度为0.8μmoL/L的内引物FIP和BIP、0.5μL终浓度为0.2μmoL/L外引物F3和B3、1μL终浓度为320U/mL的BstDNA聚合酶、1μL样品cDNA模板。进一步地，所述步骤S3具体反应过程为：将配置好的扩增反应体系配制于PCR管中，将PCR管中混合液瞬时离心混匀，于62℃的恒温条件下反应60min，然后将反应混合液再置于80℃恒温条件下反应10min。进一步地，所述步骤S4中，利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，具体实现方法为：从步骤S3得到的反应混合液中吸取5μL混合液加入到100μLLFDBuffer中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应5分钟后读取检测结果；若LFD试纸条出现两条红色条带则表明检测结果为阳性，猕猴桃待检测样品含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒；LFD试纸条仅在质控线出现红色条带表明检测结果呈阴性，猕猴桃待检测样品不含猕猴桃褪绿环斑相关病毒。(试纸条上方条带为质控线，下方出现条带为检测线，只有当质控线和检测线同时出现条带才表明该检测结果为阳性，如果仅出现质控线表明检测结果为阴性。)本专利技术的有益效果是：本专利技术根据猕猴桃褪绿环斑相关病毒外壳蛋白核苷酸序列设计LAMP引物，结合LFD试纸可视本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于RT‑LAMP‑LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的引物，其特征在于，包括4条引物：内引物：FIP和BIP；外引物：F3和B3，其中FIP和BIP的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记；各引物的序列分别如下：F3：CTTTTGTAAGATCATGCTTCCT，如SEQ ID NO.1所示；B3：TCTATTTCTATAGTGAATCGTCTTG，如SEQ ID NO.2所述；FIP：FITC‑GGTTAGATTGGAATGTCGTAAAGCTACCAGTGAATTTACAATCTCAG，如SEQ ID NO.3所示；BIP：Biotin‑AACTCATATCCTGGAACAACCATCCAGGACAAATGAGGCTACC，如SEQ ID NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的引物，其特征在于，包括4条引物：内引物：FIP和BIP；外引物：F3和B3，其中FIP和BIP的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记；各引物的序列分别如下：F3：CTTTTGTAAGATCATGCTTCCT，如SEQIDNO.1所示；B3：TCTATTTCTATAGTGAATCGTCTTG，如SEQIDNO.2所述；FIP：FITC-GGTTAGATTGGAATGTCGTAAAGCTACCAGTGAATTTACAATCTCAG，如SEQIDNO.3所示；BIP：Biotin-AACTCATATCCTGGAACAACCATCCAGGACAAATGAGGCTACC，如SEQIDNO.4所示。2.基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取猕猴桃待检测样品RNA；S2、将提取的猕猴桃待检测样品RNA反转录为cDNA；S3、以猕猴桃待检测样品cDNA为模板，配于引物FIP、BIP、F3和B3进行等温扩增；S4、利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒。3.根据权利要求2所述的基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下子步骤：S11、取猕猴桃样品置于灭菌预冷研钵中，加入液氮后，快速研磨成粉末；S12、将100mg步骤S11得到的猕猴桃样品粉末放入1.5mL离心管中，加入1mL65℃预热的2％的CTAB提取液，震荡混匀，然后放置于65℃的水浴中20min，每隔2min颠倒混匀一次；S13、在4℃环境中，于10000rpm转速下离心5min，将700μL上清液转移至新离心管；S14、加入700μL苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液，剧烈震荡混匀，所述苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；S15、在4℃环境中，于12...

【专利技术属性】
技术研发人员：席德慧，彭期定，杨婷，憨宏艳，宁佳宸，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51