鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针制造技术

本发明专利技术提供一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT‑PCR引物及探针，属于生物技术领域。本发明专利技术设计了一对针对裂谷热病毒L基因的特异性检测引物L‑F、L‑R及一条荧光探针L‑P，一对针对裂谷热病毒S片段的特异性检测引物S‑F、S‑R及一条荧光探针S‑P，并优化了该方法的特异性引物及荧光探针的浓度和反应条件。本发明专利技术提供的双重荧光定量RT‑PCR方法可以检测裂谷热病毒的感染，同时可以鉴别裂谷热病毒野生株和NSs缺失株(包括Clone 13及其他缺失株)，从而将感染动物同被免疫过的动物区分开来。具有操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本，还可以为疫情检测和控制争取到宝贵的时间。

Dual Fluorescence Quantitative RT-PCR Primers and Probes for Differential Detection of Rift Valley Fever Virus

【技术实现步骤摘要】
鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针
本专利技术属于生物检测
，涉及一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针。
技术介绍
裂谷热(Riftvalleyfever，RVF)是由裂谷热病毒(Riftvalleyfevervirus，RVFV)引起的急性出血性人兽共患病，该病主要发生于绵羊、山羊、牛和骆驼，也可以传染给啮齿动物和人。裂谷热病毒主要经蚊虫传播，也可通过接触感染或者发病动物的血液、体液、分泌排泄物等被感染。动物感染裂谷热的重症症状为发热、厌食、流涕、急性腹泻、黄疸，羔羊和犊牛死亡率高达90％，怀孕母羊和母牛流产率高达80-100％。人感染后通常无症状或者症状较轻，少于5％的病人发展为综合征，如急性肝炎、出血热或者脑炎。世界动物卫生组织(OIE)将裂谷热列为必须报告的疫病，我国将其列为一类传染病。裂谷热病毒属于布尼病毒科(Bunyaviridae)白蛉病毒属(Phlebovirus)，为单股负链RNA病毒，基因组可分为L(大)、M(中)、S(小)三个节段。其中S节段采取双义编码的方式，编码核蛋白N和非结构蛋白NSs。M节段编码两种囊膜糖蛋白，以及NSm和未知功能的结构蛋白。L节段序列高度保守，编码RNA依赖的病毒聚合酶。裂谷热最初主要在非洲撒哈拉以南地区周期性流行，2000年向北蔓延到阿拉伯半岛，引起也门和沙特阿拉伯的疫情大爆发。2016年，我国发现首例输入性裂谷热病例，警示该输入性传染病已对我国的公共卫生安全构成了现实性的威胁。因此，建立一种快速准确的针对裂谷热病毒的诊断技术方法，对于加强我国对裂谷热病毒的检测，严格控制裂谷热的输入有现实意义。目前，国际上还没有人用的裂谷热商品化疫苗，仅有少量兽用疫苗被批准，包括灭活疫苗和弱毒活疫苗。其中，Clone13弱毒活疫苗已在南非和津巴布韦获批，该NSs缺失株主要毒力因子NSs基因中含有大量缺失。灭活疫苗虽然安全，但须重复增加剂量；弱毒活疫苗虽然免疫原性较高，但存在毒力回归的生物安全隐患。有研究者建立了RVFV的T7RNA聚合酶驱动的反向遗传系统，构建NSs单独缺失和NSs/NSm同时缺失的特异性弱毒株，它的毒力比目前可用的弱毒株Clone13、MP-12和Smithburn更弱，且可以同野生毒株区分开来。这种弱毒株具有成为裂谷热疫苗的巨大潜力。因此，我们选择病毒L基因保守区域以及NSs缺失部位设计相应的引物和探针，建立双重荧光定量RT-PCR方法。该方法在快速检测裂谷热病毒的感染的同时，将能够用于区分基因缺失的疫苗毒株和野毒株，进行鉴别诊断。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于提供一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针。本专利技术提供的双重荧光定量RT-PCR引物及探针可以检测和鉴别裂谷热病毒野生株和NSs基因缺失株。技术方案本专利技术分别设计了一对针对裂谷热病毒的通用检测引物L-F、L-R及一条荧光探针L-P，一对针对野生株的特异性检测引物S-F、S-R及一条荧光探针S-P，并确定了该方法的特异性引物及荧光探针的浓度。具体为：一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针，其特征在于，所述检测裂谷热病毒的通用检测引物及探针的序列分别为：上游引物L-F：5’-TGACATACAAGGAGCATCTGAAA-3’；下游引物L-R：5’-GCCAAAGGTGAAATCGTGAAC-3’；荧光探针L-P：5’–JOE-AGGCTCAACTTTGCTACCCTCCAT-TAMRA-3’；检测裂谷热病毒非基因缺失株的特异性检测引物及探针的序列分别为：上游引物S-F：5’-AGGATGATAGTGACCGAGGCT-3’；下游引物S-R：5’-AATGAGGGCTGAGTTTGGAA-3’；荧光探针S-P：5’–FAM-CCTCAGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTGCCA-TAMRA-3’。所述双重荧光定量RT-PCR引物及探针可以制备试剂盒，可以在检测裂谷热病毒感染方面的应用，该应用仅限于诊断疾病以外的应用。所述的应用，其特征在于，(1)合成所述的引物及探针；(2)质粒标准品的制备：将包含登录号为HE687307.1的裂谷热病毒S片段和登录号为HE687305的L片段进行基因合成，并克隆至载体pMD19-T中制成阳性质粒，即为标准品，将标准品10倍梯度稀释至:1×108-1×101拷贝/μl，储存于-20℃备用；(3)待测模板的制备：将包含登录号为HE687307.1的裂谷热病毒S片段和登录号为HE687305的L片段进行基因合成，并克隆至pcDNA3.1中，转染至293T细胞，收获细胞裂解液用于制备阳性模板；取100μl血清或细胞裂解液，或取100mg组织样品，加入500μlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，12000rpm离心10分钟，取上清液100μl，加入400μlTRIzol试剂，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，加入100μl氯仿，剧烈振荡30秒，室温孵育5-10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相至另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，室温孵育30分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，RNA沉淀于管底，加入500μlDEPC处理的水配置的75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5分钟，尽量弃上清，室温晾干或真空干燥5-10分钟，用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；(4)进行双重荧光定量RT-PCR反应：裂谷热病毒感染的双重荧光定量RT-PCR方法的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有裂谷热病毒核苷酸则显示FAM和JOE阳性扩增曲线；若待检样品中含有裂谷热NSs缺失株(包括Clone13及其他NSs缺失株)核苷酸则显示JOE阳性扩增曲线，FAM无扩增信号；若待检样品中不含有裂谷热病毒核苷酸则均无扩增信号。所述双重荧光定量RT-PCR检测体系具体包括：所述双重荧光定量RT-PCR反应的反应条件为：42℃5min；95℃10s；95℃5s、60℃34s，40个循环。有益效果：本专利技术一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针选择病毒L基因保守区域以及NS缺失部位设计相应的引物和探针，建立双重荧光定量RT-PCR方法。该方法在快速检测裂谷热病毒的感染的同时，将能够用于区分基因缺失的疫苗毒株和野毒株，进行鉴别诊断，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，可为疫病监测防控提供有力工具。具体原理是分别利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体(dNTP)等成分，并应用PCR技术实现两个靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为5’端分别标记荧光报告基团FAM(S)和Joe(L)，3’段标记荧光淬灭基团(TAMRA)的两条寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT‑PCR引物及探针，其特征在于，所述检测裂谷热病毒的通用检测引物及探针的序列分别为：上游引物L‑F：5’‑TGACATACAAGGAGCATCTGAAA‑3’；下游引物L‑R：5’‑GCCAAAGGTGAAATCGTGAAC‑3’；荧光探针L‑P：5’–JOE‑AGGCTCAACTTTGCTACCCTCCAT‑TAMRA‑3’；检测裂谷热病毒非基因缺失株的特异性检测引物及探针的序列分别为：上游引物S‑F：5’‑AGGATGATAGTGACCGAGGCT‑3’；下游引物S‑R：5’‑AATGAGGGCTGAGTTTGGAA‑3’；荧光探针S‑P：5’–FAM‑CCTCAGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTGCCA‑TAMRA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR引物及探针，其特征在于，所述检测裂谷热病毒的通用检测引物及探针的序列分别为：上游引物L-F：5’-TGACATACAAGGAGCATCTGAAA-3’；下游引物L-R：5’-GCCAAAGGTGAAATCGTGAAC-3’；荧光探针L-P：5’–JOE-AGGCTCAACTTTGCTACCCTCCAT-TAMRA-3’；检测裂谷热病毒非基因缺失株的特异性检测引物及探针的序列分别为：上游引物S-F：5’-AGGATGATAGTGACCGAGGCT-3’；下游引物S-R：5’-AATGAGGGCTGAGTTTGGAA-3’；荧光探针S-P：5’–FAM-CCTCAGAGGGATTGACCTGTGCCTGTTGCCA-TAMRA-3’。2.用权利要求1所述的引物及探针制备的鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR试剂盒。3.权利要求1所述的引物及探针在鉴别检测裂谷热病毒的双重荧光定量RT-PCR中的应用，该应用仅限于诊断疾病以外的应用，其特征在于，(1)合成权利要求1所述的引物及探针；(2)质粒标准品的制备：将包含登录号为HE687307.1的裂谷热病毒S片段和登录号为HE687305的L片段进行基因合成，并克隆至载体pMD19-T中制成阳性质粒，即为标准品，将标准品10倍梯度稀释至:1×108-1×101拷贝/μl，储存于-20℃备用；(3)待测模板的制备：将包含登录号为HE687307.1的裂谷热病毒S片段和登录号为HE687305的L片段进行基因合成，并克隆至表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨蕾蕾，李文良，毛立，郝飞，李基棕，张纹纹，江杰元，孙敏，刘茂军，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32