用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽及其应用。用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽是eB2‑3和/或eB3‑3，eB2‑3是氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，eB3‑3是氨基酸序列为序列表中序列2的多肽。将该多肽和载体蛋白偶联得到的eB2‑3偶联物和/或eB3‑3偶联物作为包被原制备的抗体检测试剂盒敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对细粒棘球蚴感染血清抗体的快速大量筛选检测。

Polypeptide for preparation of diagnostic reagent for echinococcosis granulosa and its application

【技术实现步骤摘要】
用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽及其应用
本专利技术涉及用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的多肽及其应用。
技术介绍
细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)又称包生绦虫。成虫寄生于犬科食肉动物，而幼虫(棘球蚴)主要寄生于人和牛、绵羊等草食动物，引起一种严重的人兽共患病，称为细粒棘球蚴病。羊采食时吃到犬排出的细粒棘球绦虫的孕卵节片或虫卵后，卵内的六钩蚴在消化道逸出，钻入肠壁，随血液和淋巴散布到身体各处发育成成虫，引起包虫病。羊患包虫病后一般没有很好的治疗办法，发现感染后扑杀、尸体做无害化处理为主，并防止脏器被犬吃掉导致成虫寄生于终末宿主污染周围环境。所以及时的诊断检测扑杀阳性动物是防控该病传染给人的有效手段。国内外学者对筛选细粒棘球蚴的优势诊断抗原做了大量的研究，目前主要研究焦点为抗原B(AgB)。抗原B是包虫病囊液中的一种分子量为120～160kDa的耐热脂蛋白,具有高度免疫原性,并被认为是目前用于免疫诊断试验中具有较高敏感性和特异性的抗原之一。AgB是由数个约8kDa的亚基组成的多聚体,免疫印迹显示其最小亚基(8kDa)是最具有诊断价值的靶抗原。编码AgB基因是一个基因家族，含有AgB1、AgB2、AgB3、AgB4基因。江莉等利用pET32a载体、pET28a载体和pGEX4T-1载体，表达我国细粒棘球绦虫分离株(新疆源和甘肃源)中克隆的AgB1和AgB2两个亚单位基因,结果表明AgB1在pET28a载体中不能表达,而在pGEX4T-1和pET32a中可表达,但表达蛋白均为不溶性。AgB2在3种载体中均能表达,表达蛋白的溶解性依次为:不溶-部分可溶-可溶。在我国包虫病主要分为细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病两种类型。我国主要存在由细粒棘球绦虫的幼虫引起的囊型包虫病(细粒棘球蚴病)和多房棘球绦虫的幼虫引起泡型包虫病(多房棘球蚴病)，多房棘球蚴病危害严重，致死率高，又被称为“虫癌”。由于细粒棘球蚴病具有与多房棘球蚴病相似的临床症状，因此需借助实验室检测技术对该病进行确诊。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题是如何提高细粒棘球蚴抗体检测的特异性，从而更准确地诊断细粒棘球蚴病。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了用于制备细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)检测试剂的成套多肽或用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的成套多肽。本专利技术所提供的用于制备细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)检测试剂的成套多肽或用于制备细粒棘球蚴病诊断试剂的成套多肽均由eB2-3和eB3-3组成；所述eB2-3是P11、P12或P13的多肽：P11、氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，P12、氨基酸序列为序列表中序列1的第2-17位的多肽，P13、在P12的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽；所述eB3-3是P21、P22或P23的多肽：P21、氨基酸序列为序列表中序列2的多肽，P22、氨基酸序列为序列表中序列2的第2-14位的多肽，P23、在P22的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽。上述成套多肽中，序列表中序列1由17个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接，在细粒棘球蚴的AgB2的抗原表位多肽的氨基末端添加的连接臂，第2-17位来自细粒棘球蚴的AgB2；序列表中序列2由14个氨基酸残基组成，第1位的半胱氨酸残基是为了与载体蛋白连接，在细粒棘球蚴的AgB3的抗原表位多肽的氨基末端添加的连接臂，第2-14位来自细粒棘球蚴的AgB3。上述成套多肽中，所述eB2-3和所述eB3-3的质量比本领域技术人员可根据对细粒棘球蚴抗体检测效果确定，如可为4:6。上述成套多肽在制备检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述成套多肽在制备细粒棘球蚴病诊断抗原中的应用也属于本专利技术的保护范围。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂或诊断细粒棘球蚴病的试剂。本专利技术所提供的检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂或诊断细粒棘球蚴病的试剂均由eB2-3偶联物和eB3-3偶联物组成；所述eB2-3偶联物是上述eB2-3和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述eB3-3偶联物是由上述eB3-3和载体蛋白偶联得到的完全抗原。上述试剂中，所述eB2-3偶联物和所述eB3-3偶联物的质量比本领域技术人员可根据对细粒棘球蚴抗体检测效果确定，如可为4:6。上述试剂中，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、鼠血清白蛋白、甲状腺球蛋白或兔血清白蛋白。上述eB2-3或上述eB3-3也属于本专利技术的保护范围。上述eB2-3或上述eB3-3在制备检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述eB2-3或上述eB3-3在制备细粒棘球蚴病诊断抗原中的应用也属于本专利技术的保护范围。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了完全抗原。本专利技术所提供的完全抗原是上述eB2-3偶联物或上述eB3-3偶联物。上述完全抗原在制备检测细粒棘球蚴抗体的试剂中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述应用中，所述检测细粒棘球蚴抗体(细粒棘球蚴感染抗体或细粒棘球蚴病抗体)的试剂和所述细粒棘球蚴病诊断抗原均可由所述eB2-3偶联物和/或所述eB3-3偶联物组成。实验证明，分别用BSA-eB2-3和/或BSA-eB3-3作为包被抗原制备的检测血清中的细粒棘球蚴抗体的试剂盒对羊细粒棘球蚴病阴性血清、羊多房棘球蚴病阳性血清和羊囊尾蚴病阳性血清均无交叉反应，以BSA-eB2-3和BSA-eB3-3作为包被抗原的本专利技术TRFIA方法1与临床诊断的总符合率为91.67％(阳性符合率为91.11％，阴性符合率为92.22％)，以BSA-eB2-3作为包被抗原的本专利技术TRFIA方法2与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为89.44％(阳性符合率为84.44％，阴性符合率为94.44％)，以BSA-eB3-3作为包被抗原的本专利技术TRFIA方法3与羊细粒棘球蚴血清中和试验方法的总符合率为87.22％(阳性符合率为81.11％，阴性符合率为93.33％)。本专利技术以BSA-eB2-3和/或BSA-eB3-3作为包被原制备的抗体检测试剂盒特异性强、敏感性高，准确性高，操作简单、快速，适用于基层各级兽医部门和出入境检验检疫局对细粒棘球蚴感染血清抗体的快速大量筛选检测。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。以下提供的实施例可作为本
普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本专利技术的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的铕标记元素(Eu3+)为广州达瑞生物技术股份有限公司产品,兔抗山羊二抗为Sigma公司产品,Auto-DELFIA1235时间分辨荧光检测仪购自PerkinElmer股份有限公司，酶标板，购自美国Costar本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测细粒棘球蚴抗体的试剂或诊断细粒棘球蚴病的试剂，其特征在于：所述试剂由eB2‑3偶联物和eB3‑3偶联物组成；所述eB2‑3偶联物是由eB2‑3和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述eB3‑3偶联物是由eB3‑3和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述eB2‑3是P11、P12或P13的多肽：P11、氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，P12、氨基酸序列为序列表中序列1的第2‑17位的多肽，P13、在P12的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽；所述eB3‑3是P21、P22或P23的多肽：P21、氨基酸序列为序列表中序列2的多肽，P22、氨基酸序列为序列表中序列2的第2‑14位的多肽，P23、在P22的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽。

【技术特征摘要】
1.检测细粒棘球蚴抗体的试剂或诊断细粒棘球蚴病的试剂，其特征在于：所述试剂由eB2-3偶联物和eB3-3偶联物组成；所述eB2-3偶联物是由eB2-3和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述eB3-3偶联物是由eB3-3和载体蛋白偶联得到的完全抗原；所述eB2-3是P11、P12或P13的多肽：P11、氨基酸序列为序列表中序列1的多肽，P12、氨基酸序列为序列表中序列1的第2-17位的多肽，P13、在P12的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽；所述eB3-3是P21、P22或P23的多肽：P21、氨基酸序列为序列表中序列2的多肽，P22、氨基酸序列为序列表中序列2的第2-14位的多肽，P23、在P22的多肽的氨基末端或羧基末端连接氨基酸残基以与载体蛋白偶联得到的多肽。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述试剂中，所述eB2-3偶联物和所述eB3-3偶联物的质量比为4:6。3.成套多肽，其特征在于：所述成套多肽由eB2-3和eB3-3组成；所述eB2-3是P11、P12或P13的多肽：P11、氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙雨，王传彬，宋晓晖，赵晓春，肖颖，杨林，王睿男，蒋菲，白崇生，王美君，曹丽萍，央珍，李硕，刘林青，邹联斌，曾邦权，韦正吉，肖开提·阿不都克里木，王文，林汉亮，李晓霞，扎西卓玛，亢文华，刘健鹏，徐琦，苏晓慧，刘玉良，毕一鸣，马英，李舵，任娟，马晓燕，薛文，秦菊，杨天意，孙航，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心农业农村部屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：北京,11