一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法技术

本发明专利技术涉及一种一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法，包括以下步骤：将重组蛛丝蛋白包涵体悬浮于含有尿素的缓冲液中，得到悬浮液，所述悬浮液中尿素的浓度为2‑4M，所述缓冲液的pH为5‑10，然后将所述悬浮液加热至40～100℃，使重组蛛丝蛋白包涵体蛋白溶解，离心后分离出上清液，即得到可溶重组蛛丝蛋白。本发明专利技术的方法操作简单，在低浓度变性剂的作用下，简化了蛋白纯化和复性步骤，只需一步操作即可从包涵体中得到可溶的纯净重组蛛丝蛋白，节约了时间，降低了成本。

One-step heating method for dissolving recombinant spider silk protein inclusion bodies

【技术实现步骤摘要】
一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法。
技术介绍
蜘蛛丝具有优良的性能，但是无法像饲养家蚕一样大规模获取蛛丝纤维，严重阻碍了蜘蛛丝的大规模应用。然而随着生物技术的发展，人们开始探索通过基因工程技术重组表达蛛丝蛋白制备仿生蜘蛛丝。大肠杆菌作为表达外源蛋白的原核表达系统具有周期短、培养成本低、操作简单、表达水平高等优点而被广泛应用，但因大肠杆菌缺乏内质网和伴侣蛋白等真核生物中用于蛋白质折叠的关键元件，从而导致一些真核来源的蛋白或者对细胞有毒性的蛋白时经常聚集形成包涵体蛋白。传统溶解包涵体蛋白的方法一般需要用强变性剂，如8M尿素或6M盐酸胍，通过离子间的相互作用，使多肽伸展而可溶。变性的蛋白通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的伸展状态恢复到正确的高级结构。由于含有高浓度的变性剂在复性过程中需要多次重复更换缓冲液，因此需要大体积的缓冲液且耗时长。CN103833824A公开了一种溶解包涵体蛋白的方法，采用低浓度的变性剂与-20℃低温冷冻相结合的方法来溶解包涵体蛋白，该方法虽然可以有效的溶解包涵体蛋白但是不能同时去除杂质得到纯化的目的蛋白。由于蛛丝蛋白具有天然的耐热稳定性，因此已有报道利用加热法纯化蛛丝蛋白，其方法为直接将大肠杆菌裂解上清液加热，由于大肠杆菌本身的蛋白具有热不稳定性从而在加热过程中聚集沉淀，而重组表达的蛛丝蛋白仍然以可溶形式存在于上清中，从而达到分离重组蛛丝蛋白的目的。但是现有方法都是从大肠杆菌裂解液上清液中纯化可溶形式表达的蛛丝蛋白，且通过这种方法得到的重组蛛丝蛋白浓度很低，需要后续的沉淀浓缩步骤才能达到所需浓度的蛛丝蛋白溶液。而以包涵体形式表达的蛛丝蛋白现有方法仍然采用传统的高浓度变性剂来溶解包涵体蛋白，不仅对其结构上造成很大的破坏且在蛋白复性过程中耗时。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法，通过直接加热蛛丝蛋白包涵体既可以使得目的蛋白从包涵体中释放，同时还可以使得包涵体中的杂质蛋白在加热过程中保持在沉淀中，达到分离纯化的目的，且目的蛋白不会被稀释。本专利技术的方法操作简单，在低浓度变性剂的作用下，简化了蛋白纯化和复性步骤，只需一步操作即可从包涵体中得到可溶的高浓度纯净重组蛛丝蛋白，节约了时间，降低了成本。本专利技术的目的是提供一种一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法，包括以下步骤：将重组蛛丝蛋白包涵体悬浮于含有尿素的缓冲液中，得到悬浮液，所述悬浮液中尿素的浓度为2-4M(优选为4M)，所述缓冲液的pH为5-10(优选为pH8-10，更优选为pH8)，然后将所述悬浮液加热至40～100℃(优选为85℃)，使重组蛛丝蛋白包涵体蛋白溶解，离心后分离出上清液，即得到可溶重组蛛丝蛋白。进一步地，所述重组蛛丝蛋白包涵体的制备方法包括以下步骤：将重组表达蛛丝蛋白包涵体的菌体破碎后离心，弃上清液后，将得到的沉淀物用洗涤缓冲液洗涤3-5次，即得到所述重组蛛丝蛋白包涵体。其中，所述重组表达蛛丝蛋白包涵体的菌体中含有重组质粒pET-32a-NM。优选地，重组表达蛛丝蛋白包涵体的菌体为大肠杆菌。进一步地，重组蛛丝蛋白包涵体的制备方法中，所述洗涤缓冲液的pH值为8。进一步地，重组蛛丝蛋白包涵体的制备方法中，采用超声法对菌体进行破碎。进一步地，溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法中，所述悬浮液中重组蛛丝蛋白包涵体的浓度为10mg/ml。进一步地，溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法中，缓冲液为Tris缓冲液。进一步地，溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法中，加热时间为20min。进一步地，溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法中，离心转速为12000r/min，离心温度为4℃。本专利技术在包涵体蛋白水平上，将低浓度的变性剂与高温加热相结合的方法来溶解重组蛛丝包涵体蛋白。其原理是高温使得重组蛛丝蛋白包涵体解聚，由于蛛丝蛋白本身具有热稳定性解聚后可以稳定的存在于上清液中，而重组蛛丝蛋白包涵体中的杂质蛋白由于热不稳定性，在高温作用下彻底失活变成蛋白聚集体存在于沉淀中。而低浓度的变性剂则有利于维持蛋白结构的稳定，防止重组蛛丝蛋白聚集体的重新形成。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术将包涵体形式存在的重组蛛丝蛋白在含有低尿素浓度的溶液中重悬包涵体并加热，从而使得重组蛛丝蛋白以可溶状态存在于上清中，而包涵体中的其他杂质蛋白因为热不稳定性而聚集在沉淀中，本方法通过一步加热法，既实现了从包涵体中溶解目的蛋白，又实现了纯化目的蛋白的目的。本专利技术的方法操作简单，从包涵体中得到的目的蛋白含有较低浓度的变性剂，为后续蛋白复性简化了操作步骤，节约了时间，同时去除了包涵体中的杂质蛋白省掉了纯化步骤，得到了高纯度的可溶的目的蛋白，使获得的重组蛛丝蛋白可以在生物材料及组织工程中具有广泛应用。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是实施例1中，不同尿素浓度下，采用本专利技术的加热法溶解包涵体蛋白所得蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果；图2是实施例1中，不同尿素浓度下，采用传统尿素变性法溶解包涵体蛋白所得蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果；图3是实施例2中，不同温度对本专利技术的加热法所得蛋白的溶解性影响结果；图4是实施例3中，不同pH值对本专利技术的加热法所得蛋白的溶解性影响结果；图5是本专利技术的一种一步加热法溶解重组蛛丝蛋白包涵体方法的过程示意图。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1将大腹园蛛次壶腹腺丝基因的N末端非重复区和一个重复区的基因序列根据大肠杆菌密码子偏好性优化后构建于原核表达载体pET-32a，构建表达质粒pET-32a-NM并转化大肠杆菌BL21，经37℃诱导表达后重组蛛丝(NM)蛋白以包涵体的形式表达，然后利用本专利技术方法溶解NM包涵体蛋白，其具体操作如下：(1)诱导表达含有重组质粒pET-32a-NM的大肠杆菌菌株500mL，蛋白诱导表达条件为37℃，IPTG浓度1mM，诱导表达4h；(2)4℃，12000r离心30min收集菌体，然后30mL的PBS重悬并用超声波破碎；(3)将上一步破碎的菌体在4℃，12000r离心30min，弃上清得到包涵体蛋白沉淀；(4)用洗涤缓冲液(20MmTris,300mMNaCl,1mMEDTA,1％TritonX-100,1Murea,pH8.0)洗涤包涵体蛋白沉淀3次(5)将洗涤干净的包涵体蛋白用Tris缓冲液重悬，等体积分装为35管，编号分别为1至35，4℃，12000r离心30min，弃上清；(6)将得到的1至16管包涵体蛋白沉淀用pH8的Tris缓冲液重悬，包涵体蛋白浓度为10mg/mL。其中1至8管分别含有0、1、2、3、4、5、6、7M尿素，然后将1至8管置于室温(25℃)溶解20min。同时，9至16管也分别含有0、1、2、3、4、5、6、7M尿素，然后将9至16管置于85度加热20min；(7)将步骤(6)处理后的各管12000r离心30min，收集上清，得到从包涵体中释本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组蛛丝蛋白包涵体重悬于含有尿素的缓冲液中，得到悬浮液，所述悬浮液中尿素的浓度为2‑4M，所述缓冲液的pH为5‑10，然后将所述悬浮液加热至40～100℃，使重组蛛丝蛋白包涵体蛋白溶解，离心后分离出上清液，即得到可溶重组蛛丝蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种溶解重组蛛丝蛋白包涵体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组蛛丝蛋白包涵体重悬于含有尿素的缓冲液中，得到悬浮液，所述悬浮液中尿素的浓度为2-4M，所述缓冲液的pH为5-10，然后将所述悬浮液加热至40～100℃，使重组蛛丝蛋白包涵体蛋白溶解，离心后分离出上清液，即得到可溶重组蛛丝蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛛丝蛋白包涵体的制备方法包括以下步骤：将重组表达蛛丝蛋白包涵体的菌体破碎后离心，弃上清液后，将得到的沉淀物用洗涤缓冲液洗涤3-5次，即得到所述重组蛛...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐兴梅，熊思东，蔡慧，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32