一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒。本发明专利技术提供的试剂盒包括引物探针组合CSF‑F1R1P1和ASF‑F1R1P1；所述引物探针组合CSF‑F1R1P1由CSF‑F1、CSF‑R1和CSF‑P1组成；CSF‑F1为序列1所示；CSF‑R1为序列2所示；CSF‑P1如序列3所示；所述引物探针组合ASF‑F1R1P1由ASF‑F1、ASF‑R1和ASF‑P1组成；ASF‑F1为序列4所示；ASF‑R1为序列5所示；ASF‑P1如序列6所示。本发明专利技术对于猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的防控具有重大的应用价值，有助于从源头控制疫情、有效预防猪疫病的大规模爆发。

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒
本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒。
技术介绍
猪瘟(Swinefever，SF)又名猪霍乱(HogCholera，HC)，我国俗称烂肠瘟。欧洲为了区别于非洲猪瘟称其为古典猪瘟(Classicalswinefever，CSF)。猪瘟是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性病毒传染病，其特征是小血管壁变性、内脏器官多发性出血、坏死和梗死。传播快、流行广、发病率和死亡率高，危害极大。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告疫病，我国2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟(AfricanSwineFever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的传染病，可影响所有年龄的猪，引起出血热，急性发病时的致死率可达100％。非洲猪瘟严重威胁养猪业生产，并且因疫情引发贸易限制，对国际贸易产生重大影响。ASF具有极强的跨境传播能力，已引起各国政府和国际组织越来越多的重视。我国在2018年8月之前从未发现过ASF，并始终将其列为重点防范的外来动物疫病。目前，最常用的核酸检测方法有RT-PCR和荧光RT-PCR。RT-PCR和荧光RT-PCR虽然较之以往方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好，且自动化程度高等特点，但是上述方法均只能实现定性和半定量的检测，无法对病毒核酸进行精确定量，在灵敏度和敏感性特异性上仍存在一定的局限性。数字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。ABI公司的QuantStudio3D数字PCR系统是一款基于芯片的仪器，它的第一代芯片能够在每次运行中最多产生20,000个0.8nL液滴，满足了目前大部分数字PCR应用的需求。QuantStudio3D数字PCR系统包括三台仪器：芯片装载仪、芯片分析仪和GeneAmpPCRSystem9700，及其相关的耗材。采用芯片数字PCR可实现灵敏且精确的绝对靶位点定量，无需使用参照或标准曲线，从而能够应用于新的领域。研究人员现在不仅可以获得CT值，还可以实现绝对定量，包括小概率事件检测或样本中的精确靶点计数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪瘟和非洲猪瘟双重数字PCR检测技术及其专用试剂盒。本专利技术首先保护一种引物探针组合，其由引物探针组CSF-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成；所述引物探针组CSF-F1R1P1由引物CSF-F1、引物CSF-R1和探针CSF-P1组成；所述引物CSF-F1为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物CSF-R1为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述探针CSF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物探针组ASF-F1R1P1由引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1组成；所述引物ASF-F1为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物ASF-R1为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述探针ASF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；所述探针CSF-P1和所述探针ASF-P1具有不同颜色的荧光报告基团。在本专利技术的具体实施例中，所述探针CSF-P1的5’末端标记荧光基团FAM，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。所述探针ASF-P1的5’末端标记荧光基团HEX，3’末端标记荧光淬灭基团BHQ1。所述引物探针组合的用途为如下(b1)-(b6)中的任一种：(b1)鉴定猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒；(b2)制备用于鉴定猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；(b3)检测待测样本是否含有猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒；(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；(b5)检测待测样本中猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量；(b6)制备用于检测待测样本中猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒含量的试剂盒。本专利技术还保护所述引物探针组合在如下(b1)-(b6)中任一种中的应用：(b1)鉴定猪瘟病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种引物探针组合，其由引物探针组CSF-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成；/n所述引物探针组CSF-F1R1P1由引物CSF-F1、引物CSF-R1和探针CSF-P1组成；/n所述引物CSF-F1为如下(a1)或(a2)：/n(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；/n(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；/n所述引物CSF-R1为如下(a3)或(a4)：/n(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；/n(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；/n所述探针CSF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：/n(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；/n(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；/n所述引物探针组ASF-F1R1P1由引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1组成；/n所述引物ASF-F1为如下(a7)或(a8)：/n(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；/n(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；/n所述引物ASF-R1为如下(a9)或(a10)：/n(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；/n(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；/n所述探针ASF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a11)或(a12)：/n(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；/n(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；/n所述探针CSF-P1和所述探针ASF-P1具有不同颜色的荧光报告基团。/n...

【技术特征摘要】
1.一种引物探针组合，其由引物探针组CSF-F1R1P1和引物探针组ASF-F1R1P1组成；
所述引物探针组CSF-F1R1P1由引物CSF-F1、引物CSF-R1和探针CSF-P1组成；
所述引物CSF-F1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物CSF-R1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述探针CSF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物探针组ASF-F1R1P1由引物ASF-F1、引物ASF-R1和探针ASF-P1组成；
所述引物ASF-F1为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物ASF-R1为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述探针ASF-P1，一个末端具有荧光报告基团，另一个末端具有荧光淬灭基团，核苷酸序列为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述探针CSF-P1和所述探针ASF-P1具有不同颜色的荧光报告基团。


2.权利要求1所述的引物探针组合在如下(b1)-(b6)中任一种中的应用：
(b1)鉴定猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(b2)制备用于鉴定猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(b3)检测待测样本是否含有猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(b4)制备用于检测待测样本是否含有猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的试剂盒；
(b5)检测待测样本中猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒的含量；
(b6)制备用于检测待测样本中猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒含量的试剂盒。


3.一种试剂盒，其包括权利要求1所述的引物探针组合；所述试剂盒的功能为如下(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)鉴定猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒；
(c2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：原霖，王传彬，杨林，宋晓晖，董浩，蒋菲，汪葆玥，李硕，张硕，孙雨，曲萍，亢文华，周智，倪建强，刘玉良，王睿男，胡冬梅，毕一鸣，
申请(专利权)人：中国动物疫病预防控制中心农业农村部屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：北京;11