一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基技术

本发明专利技术涉及了一种发酵法生产茴香霉素的方法，所述方法包括：a.菌种斜面培养，制备孢子悬液；b.菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液；c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液；d.对所述种子罐种子液进行发酵培养；本发明专利技术的生产茴香霉素的方法和在发酵过程中配置的多种培养基，能够有效提高发酵法生产茴香霉素的效价，缩短茴香霉素的发酵周期，有利于茴香霉素的大规模产业化生产。

A Fermentation Method and Culture Medium for Anisomycin Production

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基
本专利技术属于微生物发酵
，特别涉及种发酵生产茴香霉素的方法及培养基。
技术介绍
茴香霉素(Anisomycin)是由浅灰链霉菌(Streptomycesgriseus)等放线菌产生的一种含氮杂环类芳香族抗生素，具有很好的抗真菌、抗原虫和和抗肿瘤作用。目前广泛应用于细胞与分子遗传学领域研究，同时具有作为免疫抑制药物开发的巨大潜力。茴香霉素化学结构中含有4个手性中心，包括3个手性碳原子和1个手性氮原子，采用化学合成的方法进行茴香霉素生产存在手性催化剂成本昂贵、反应条件苛刻、对映体分离困难、环境污染严重等诸多难题。虽然目前有浅灰链霉菌等多株链霉菌可以产生茴香霉素，但茴香霉素的发酵水平均很低，且发酵液代谢产物复杂、化学结构相近，导致茴香霉素提取精制工艺复杂、收率低、成本高，严重束缚了茴香霉素的生产和应用。目前国内外文献报道的茴香霉素的发酵水平很低，尚无茴香霉素大规模发酵生产的报道与专利。通过菌种改良和发酵工艺优化提高茴香霉素的发酵水平，具有很高的经济应用价值。但是菌种的改良主要通过诱变育种、基因工程育种等方法进行，但育种过程存在随机性大、开发周期长等缺陷，因此需要一种对培养基进行优化和对发酵工艺进行改进的方法来提高茴香霉素发酵水平。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基。一种发酵法生产茴香霉素的方法，所述方法包括：a.菌种斜面培养，制备孢子悬液：将梯度稀释后的所述菌种涂布于含孢子培养基的平板上，挑取所述平板上的单菌落接种于含孢子培养基的斜面上，待孢子成熟丰满后加无菌水制备含菌种孢子的孢子悬液；b.进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液：将所述孢子悬液接入摇瓶种子培养基中；在温度28～30℃、摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液；c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液：将所述摇瓶种子液转接至装有无菌种子罐培养基中，在温度为28～30℃、搅拌转速为250～350rpm、通气量为40～80m3/h、罐压为40～60KPa的条件下培养20～24小时，制得种子罐种子液；d.对所述种子罐种子液进行发酵培养：将所述种子罐种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中，在温度为28～30℃、搅拌转速为100～200rpm、通气量为150～300m3/h、罐压为40～60KPa、pH为6.0～8.0的条件下发酵培养30～36小时，制得含茴香霉素的发酵液。进一步地，所述菌种为冻干管保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796型菌种。进一步地，含孢子培养基的所述平板和所述斜面的培养温度均为28～30℃、培养时间均为6～7天。进一步地，所述种子罐内部的种子培养物质的体积占所述种子罐体积的60％～80％，所述摇瓶种子液按所述种子罐培养基体积的0.75～1.5‰接种量接种至所述种子罐培养基中。进一步地，所述发酵培养基的体积占所述发酵罐体积的60％～80％，所述种子罐种子液按所述发酵培养基体积的5～10％接种量接种于所述发酵罐中。进一步地，步骤d中所述发酵培养还包括通过补加生理碱性物质控制所述发酵罐内发酵液pH：在发酵前10～15小时，不对所述发酵罐内的发酵液pH进行控制；发酵过程中所述发酵罐内发酵液的pH逐渐下降，当所述发酵罐内发酵液pH低于6.0时，通过流加生理碱性物质控制发酵液pH在6.0～6.5；发酵后期停止流加生理碱性物质。进一步地，所述生理碱性物质为氨水。进一步地，所述培养基包括孢子培养基、摇瓶种子培养基、种子罐培养基和发酵培养基；所述孢子培养基，用于培养菌种孢子；所述摇瓶种子培养基，用于培养摇瓶种子；所述种子罐培养基，用于培养种子罐种子；所述发酵培养基，用于菌种进行发酵培养。进一步地，所述孢子培养基由以下组分制成：可溶性淀粉15～25g/L、黄豆饼粉25～35g/L、轻质碳酸钙5～15g/L、七水硫酸镁2.5～7.5g/L和琼脂粉15～25g/L；所述孢子培养基的pH为7.0～7.5。进一步地，所述摇瓶种子培养基由以下组分制成：葡萄糖2.5～7.5g/L、酵母粉2.5～7.5g/L、玉米浆7.5～15g/L和硫酸镁2.5～7.5g/L；所述摇瓶种子培养基的pH为7.0～7.3。进一步地，所述种子罐培养基由以下组分制成：葡萄糖2.5～7.5g/L、酵母粉2.5～7.5g/L、玉米浆7.5～15g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L；所述种子培养基pH为7.0～7.5，所述种子培养基放置于种子罐中。进一步地，所述发酵培养基由以下组分制成：甘油15～25g/L、黄豆粉20～40g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L、硫酸锰2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L；所述发酵培养基pH为7.0～7.5，所述发酵培养基放置于发酵罐中。本专利技术的发酵法生产茴香霉素的方法和在发酵过程中配置的多种培养基，能够有效提高发酵法生产茴香霉素的效价，使茴香霉素最终效价达到500ug/ml以上，缩短茴香霉素的发酵周期，发酵周期不超过40小时，显著降低了发酵成本，有利于茴香霉素的大规模产业化生产。本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1示出了根据本专利技术实施例发酵法生产茴香霉素的流程示意图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种发酵法生产茴香霉素的方法，如图1所示，本方法包括以下步骤：步骤一：菌种斜面培养，制备孢子悬液。对菌种进行培养前，需准备孢子培养基，进行孢子培养，制备孢子悬液。孢子悬液制备过程为：取冻干保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796菌种，进行梯度稀释后，取最小浓度的菌液涂布于孢子培养基的平板上，28～30℃恒温培养6～7天，挑取单菌落接种于上述10支装有孢子培养基的斜面上，28～30℃继续恒温培养6～7天，待孢子成熟丰满后取1支斜面加入20ml无菌水制备孢子悬液。步骤二：进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液。对孢子悬液继续培养前，取制备好的摇瓶种子培养基，确保菌种孢子的稳定生长。摇瓶种子培养过程：将步骤一中培养的孢子悬液接入摇瓶种子培养基中，在温度28～30℃，摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液。其中，温度优选为28℃，摇床转速优选为220rpm，培养时间优选培养22小时。步骤三：将摇瓶种子液接入种子罐培养基中，培养种子罐种子液。在种子罐种子培养前，制备种子培养物质，并将种子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵法生产茴香霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：a.菌种斜面培养，制备孢子悬液：将梯度稀释后的所述菌种涂布于含孢子培养基的平板上，挑取所述平板上的单菌落接种于含孢子培养基的斜面上，待孢子成熟丰满后加无菌水制备含菌种孢子的孢子悬液；b.进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液：将所述孢子悬液接入摇瓶种子培养基中；在温度28～30℃、摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液；c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液：将所述摇瓶种子液转接至装有无菌种子罐培养基中，在温度为28～30℃、搅拌转速为250～350rpm、通气量为40～80m

【技术特征摘要】
1.一种发酵法生产茴香霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：a.菌种斜面培养，制备孢子悬液：将梯度稀释后的所述菌种涂布于含孢子培养基的平板上，挑取所述平板上的单菌落接种于含孢子培养基的斜面上，待孢子成熟丰满后加无菌水制备含菌种孢子的孢子悬液；b.进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液：将所述孢子悬液接入摇瓶种子培养基中；在温度28～30℃、摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液；c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液：将所述摇瓶种子液转接至装有无菌种子罐培养基中，在温度为28～30℃、搅拌转速为250～350rpm、通气量为40～80m3/h、罐压为40～60KPa的条件下培养20～24小时，制得种子罐种子液；d.对所述种子罐种子液进行发酵培养：将所述种子罐种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中，在温度为28～30℃、搅拌转速为100～200rpm、通气量为150～300m3/h、罐压为40～60KPa、pH为6.0～8.0的条件下发酵培养30～36小时，制得含茴香霉素的发酵液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种为冻干管保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796型菌种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，含孢子培养基的所述平板和所述斜面的培养温度均为28～30℃、培养时间均为6～7天。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子罐内部的种子培养物质的体积占所述种子罐体积的60％～80％，所述摇瓶种子液按所述种子罐培养基体积的0.75～1.5‰接种量接种至所述种子罐培养基中。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的体积占所述发酵罐体积的60％～80％，所述种子罐种子液按所述发酵培养基体积的5～10％接种量接种于所述发酵罐中。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养还包括通过补加生理碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭霞凌，李辉，
申请(专利权)人：大邦湖南生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43