转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法技术

本发明专利技术公开了转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因的表达；一种转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法；本发明专利技术可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。

Multilevel Hypoxia Regulatory Genes after Transcription, Transcription and Translation, Their Application and Regulation Methods

【技术实现步骤摘要】
转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法。
技术介绍
在缺血相关疾病(如缺血性卒中)基因治疗的过程中，作为一种外源基因，如果治疗基因不加以调控，过表达的话可能会引起不良副作用，如肿瘤、癫痫等。在缺血相关疾病发生的病理生理过程中存在局部缺血/低氧微环境，针对这一特点，我们可以利用缺血/低氧靶向调控系统来实现对治疗基因表达的缺血/低氧靶向调控，使其在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。基因表达是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。因此我们可以从转录前、转录后、翻译后水平对基因的表达进行缺血/低氧靶向调控，如图1所示。在转录水平的调控主要是通过其中低氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)和低氧反应元件(hypoxiaresponsiveelement，HRE)低氧特异性结合后启动下游基因转录的机制来实现的。在常氧条件下，HIF-1α表达水平较低，而且极不稳定，迅速被降解；但在低氧/低氧环境下，HIF-1α表达水平上调、稳定性增强，与HIF-1β形成二聚体后，结合于相关基因的HRE，启动下游基因的转录。在我们前期的研究中已经通过5个拷贝的HRE在转录水平实现了对治疗基因NT-3的缺血/低氧靶向调控表达，但是在常氧条件下5HRE还是会启动下游基因的表达，尽管表达量很少。这就需要联合转录后和翻译后水平的低氧靶向调控，以降低或者消除转录水平低氧靶向调控遗漏的基因表达。在转录后水平可以通过低氧相关基因5'-端或3'-端一段非翻译区(untranslatedregions，UTR)控制mRNA的稳定性来调节基因的转录后水平(图1)。在常氧条件下含有Epo3'-的UTR的mRNA的不稳定，迅速被降解；而在低氧条件下Epo3'-端UTR可以增强mRNA的稳定性，进而使相关基因表达增多。在翻译后水平主要通过针对蛋白的稳定性来进行调节，在此过程中HIF-1α中部的氧依赖的降解(oxygen-dependentdegradation，ODD)结构域起着重要作用(图1)。在低氧条件下，在常氧条件下，含有ODD结构域的融合蛋白稳定性差，会迅速被降解；而在低氧条件下，含有ODD结构域的融合蛋白的稳定性增强，进而使其维持在一定的表达水平。因此，在低氧靶向性调控表达过程中，UTR和ODD结构域可以降低或消除转录水平低氧靶向调控遗漏的蛋白表达，可以进一步增强对治疗基因的低氧靶向调控。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因、应用及其调控方法，以解决在转录、转录后和翻译后多水平调控低氧调控基因的表达问题。本专利技术采用以下技术方案：转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因的用途，用于低氧靶向调控治疗基因的表达。一种转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，由以下步骤组成：用低氧调控基因构建重组质粒；将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中；控制环境中氧气含量，使得环境中氧气含量在小于1.5％，低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。进一步地，重组质粒为pLNCX载体重组质粒。进一步地，在获得有人ODD基因的重组质粒时，将连接反应体系转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人ODD基因的重组质粒pT-ODD。进一步地，在获得有人UTR基因的重组质粒时，将连接反应体系转化至大肠杆菌JM109感受态细胞内进行克隆、抽提出携带有人UTR基因的重组质粒pT-UTR。进一步地，环境中氧气含量在为0.3％。本专利技术的有益效果是：本专利技术可以对低氧调控基因在常氧条件下或者正常组织中低表达甚至不表达，而在低氧条件下或者缺血组织中表达上调，进而在实现有效的治疗的同时，避免或者降低治疗基因过表达可能引起的不良副作用的风险。【附图说明】图1为本专利技术的基因表达的转录、转录后和翻译后低氧靶向调节示意图；图2为本专利技术中质粒pT-NT3的酶切和PCR鉴定结果；图3为本专利技术中质粒pT-UTR的酶切和PCR鉴定结果；图4为本专利技术实施例1反转录PCR和westernblot分别检测NT-3mRNA和蛋白的表达情况。【具体实施方式】下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术公开了转录、转录后和翻译后水平低氧调控基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。SEQIDNO：1：ggtaccccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccacagtgcatacgtgggctccaacaggtcctctttgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatcgctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttacgcgtcggtgatgtccatcttgttttatgtgatatttctcgcttatctccgtggcatccaaggtaacaacatggatcaaaggagtttgccagaagactcgctcaattccctcattattaagctgatccaggcagatattttgaaaaacaagctctccaagcagatggtggacgttaaggaaaattaccagagcaccctgcccaaagctgaggctccccgagagccggagcggggagggcccgccaagtcagcattccagccggtgattgcaatggacaccgaactgctgcgacaacagagacgctacaactcaccgcgggtcctgctgagcgacagcacccccttggagcccccgcccttgtatctcatggaggattacgtgggcagccccgtggtggcgaacagaacatcacggcggaaacggtacgcggagcataagagtcaccgaggggagtactcggtatgtgacagtgagagtctgtgggtgaccgacaagtcatcggccatcgacattcggggacaccaggtcacggtgctgggggagatcaaaacgggcaactctcccgtcaaacaatatttttatgaaacgcgatgtaaggaagccaggccggtcaaaaacggttgcaggggta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因的用途，其特征在于，用于低氧靶向调控治疗基因的表达。3.一种采用权利要求1的转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，其特征在于，由以下步骤组成：用所述低氧调控基因构建重组质粒；将低氧调控基因通过重组质粒转入真核细胞中；控制环境中氧气含量，使得环境中氧气含量在小于1.5％，所述低氧调控基因开始调控治疗基因的表达。4.根据权利要求3所述的转录、转录后和翻译后多水平低氧调控基因低氧靶向调控治疗基因的方法，其特征在于，所述重组质粒为pL...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军峰，徐曦，祁存芳，张建水，苏兴利，赵朝华，徐浩，张力，庞龙，魏亮，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61