草鱼补体C5基因、用于克隆草鱼补体C5基因的引物及克隆方法技术

一种草鱼补体C5基因、用于克隆草鱼补体C5基因的引物及克隆方法，其是设计扩增草鱼补体C5基因的保守结构域核苷酸片段的引物，将提取的草鱼RNA反转录成cDNA第一链，以此为模板PCR扩增得cDNA保守结构域核苷酸片段；并根据该保守结构域片段设计5’‑RACE下游内外巢引物和3’‑RACE上游内外巢引物，再分别以5′‑RACE‑Ready cDNA和3′‑RACE‑Ready cDNA为模板，扩增得到草鱼补体C5基因的cDNA 5′端和cDNA 3′端片段；将cDNA保守结构域核苷酸片段、cDNA 5′端和cDNA 3′端片段进行拼接得到草鱼补体C5基因的全长cDNA序列。

Grass carp complement C5 gene, primers and cloning methods for cloning grass carp complement C5 gene

【技术实现步骤摘要】
草鱼补体C5基因、用于克隆草鱼补体C5基因的引物及克隆方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种草鱼补体C5基因，同时还涉及用于克隆该基因的引物和克隆方法。
技术介绍
补体C5是补体系统中一种重要组分，是含硫酯键的α-2巨球蛋白超家族，其基因序列与补体C3、补体C4具有高度的同源性，但在功能上，补体C5参与所有补体激活途径，活化产生过敏毒素小片段C5a和C5b，C5b随后形成膜攻击复合体C5b-9，穿透细胞膜，C5a则能介导白细胞呼吸暴发，但这种介导功能具有种的特异性。目前有关补体C5基因在人类、小鼠、虹鳟、鲤鱼、牛这几种生物钟都有报道，但没有关于草鱼补体C5基因cDNA的克隆和序列分析方面的研究报道。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有技术的不足，提供一种草鱼补体C5基因、用于克隆草鱼补体C5基因的引物及克隆方法，通过RACE法，从草鱼肝脏中克隆得到草鱼补体C5基因cDNA全长序列，并利用软件对其进行氨基酸理化性质分析、信号肽预测、三级结构预测和同源性分析，为进一步研究该基因的结构和功能奠定基础，同时也为草鱼补体其他基因的研究提供可靠的参考。本专利技术所采用的技术方案是：草鱼补体C5基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术同时提供草鱼补体C5基因编码的氨基酸，序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供用于克隆草鱼补体C5基因的引物，其中，该引物分别为C5-ORF-F/R、C5-5'-外、C5-3'-外，序列分别如下：C5-ORF-F：AATTCTGCAGTCGACGGTACCATGGCACGTTTATTTTTGTTCTGT，C5-ORF-R：ATGGTGGCGACCGGTGGATCCGCATCACAGCCCGATAATAAGAAATCT；C5-5'-外:GATTACGCCAAGCTTAGCAATTCCATCTCCCCGACTCGTCACT，C5-3'-外：5’-AATGTCAATTGACATTCATGACAGCGT-3’。本专利技术还提供一种克隆草鱼补体C5基因的方法，其中，该方法步骤如下：(1)从草鱼肝脏中提取总RNA；(2)设计扩增草鱼补体C5基因的保守结构域核苷酸片段的引物C5-ORF-F和C5-ORF-R，将提取的草鱼RNA反转录成cDNA第一链；并以合成的cDNA第一链为模板，PCR扩增得cDNA保守结构域核苷酸片段；(3)利用试剂盒合成草鱼补体C5基因的5′-RACE-ReadycDNA和3′-RACE-ReadycDNA；(4)根据步骤(2)扩增得到的cDNA保守结构域片段设计5’-RACE下游内外巢引物和3’-RACE上游内外巢引物，并分别以步骤(3)合成的5′-RACE-ReadycDNA和3′-RACE-ReadycDNA为模板，扩增得到草鱼补体C5基因的cDNA5′端和cDNA3′端片段；(5)将cDNA保守结构域核苷酸片段、cDNA5′端和cDNA3′端片段进行拼接得到草鱼补体C5基因的全长cDNA序列。上述引物C5-ORF-F和C5-ORF-R是根据NCBI中草鱼补体C5基因序列设计的。本专利技术首次用该专利技术的针对草鱼补体C5基因的克隆RACE方法获得草鱼补体C5基因的cDNA全长序列。该草鱼补体C5基因cDNA序列全长5365bp，编码1693个氨基酸，同源性分析表明，草鱼补体C5基因和鲤鱼在进化上亲缘关系最近，同源性为79.33％；并在草鱼补体C5蛋白中发现有A2M-N-2、ANATO、A2M、A2M–recep和C345C五个共同结构域，从生物信息学方面确定了草鱼补体C5的存在。由于草鱼补体C5序列较长，对于每一步实验条件的要求都比较高，因此本专利技术通过不断优化实验条件，探索出克隆草鱼补体C5基因的最佳实验体系。其中最大的特点是通过对引物的修饰，将引物TM控制在理想范围之内，设计出了高度有效的5’和3’端的引物。并将最终结果通过NCBIBlast比对，确证草鱼补体C5cDNA序列的完整性。附图说明图1是草鱼补体C5的cDNA基因氨基酸序列中的信号肽切割位点图。其中，C-score：用来区分是否为剪切位点，最高峰值为剪切位点后的第一个氨基酸(即成熟蛋白的第一个氨基酸残基)；S-score：用来区分相应位置是否为信号肽区域；Y-score：C-score和S-score的几何平均数，用于避免多个高分C-score值对结果的影响。图2是草鱼补体C5的蛋白质跨膜结构示意图。其中，左侧的圈代表第一个跨膜结构，位于4-25aa；右侧的圈代表第二个跨膜结构，位于904-925aa。图3是草鱼补体C5的系统发育树。图4是SWISS-MODEL预测草鱼补体C5蛋白同源三级结构模型。具体实施方式为了更好的解释本专利技术，以下结合具体的实施例进一步阐明本专利技术的主要内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于以下实施例。实施例1草鱼补体C5蛋白基因cDNA全长序列结构与分析实验动物与样品采集：1龄健康草鱼采自湖南浏阳市乌龙渔场渔场。丁香麻醉后解剖采集草鱼肝脏，剪成100mg左右大小分装样品管中，液氮速冻，-70℃保存备用。1.草鱼肝脏总RNA抽提将用于研磨组织的研钵于烤箱中180℃烘烤4小时，待研钵冷却至室温后，注入液氮预冷，使研钵的温度与-70℃保存的草鱼肝脏组织样本基本一致。取-70℃保存的肝脏冰冻组织约100mg置于已预冷的研钵中，迅速加入液氮把肝脏组织反复研磨成粉末。在已经研磨成粉末的草鱼肝脏组织中加入总RNA提取液，迅速匀浆；把研钵中的匀浆液转移到已经DEPC处理的一无RNase的离心管中；12000r/min、4℃离心10min，留取上清，室温静置5分钟，加入1mL氯仿，上下颠倒混匀15秒，又室温静置8分钟，12000r/min、4℃离心15分钟；取最上层上清液至另一干燥的无RNase离心管，加与上清液等体积异丙醇，上下颠倒混匀20秒，室温放置10分钟，再12000r/min、4℃离心10分钟；离心，小心吸除上清，在留取的下层液中加入DEPC水配制的75％乙醇1mL，悬浮沉淀，7500r/min、4℃离心5分钟，后再重复7500r/min、4℃离心5分钟，小心彻底吸除乙醇，留取沉淀，室温干燥30分钟，加30μL无RNase的灭菌去离子水，置于55℃水浴锅中溶解沉淀；检测提取的草鱼肝脏总RNA浓度和纯度。样品的浓度计算公式：[RNA]＝OD260×D×40ng/μL，其中，D为样品的稀释倍数，根据OD260/OD280比值判断RNA的纯度。2.草鱼补体C5基因的5′-RACE-ReadycDNA和3′-RACE-ReadycDNA的合成使用Clontech公司SMARTRACEcDNAAmplificationKit试剂盒分别合成草鱼补体C5基因的5′-RACE-ReadycDNA和3′-RACE-ReadycDNA，用TEBuffer稀释10倍-20℃保存备用。3.草鱼补体C5基因的cDNA保守结构域核苷酸片段序列克隆根据NCBI中草鱼补体C5基因序号AUW36852.1序列设计扩增草鱼补体C5基因保守结构域核苷酸片段的引物：C5-ORF-F：AATTCTGCAGTCGACGGTACCATGGCACGTTTATTTTTGTTCTGT，SEQIDNO.3，C5-ORF-R：ATGGTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.草鱼补体C5基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.草鱼补体C5基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的草鱼补体C5基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种用于克隆草鱼补体C5基因的引物，其中，该引物分别为C5-ORF-F/R、C5-5'-外、C5-3'-外，序列分别如下：C5-ORF-F：AATTCTGCAGTCGACGGTACCATGGCACGTTTATTTTTGTTCTGT，C5-ORF-R：ATGGTGGCGACCGGTGGATCCGCATCACAGCCCGATAATAAGAAATCT；C5-5'-外:GATTACGCCAAGCTTAGCAATTCCATCTCCCCGACTCGTCACT，C5-3'-外：5’-AATGTCAATTGACATTCATGACAGCGT-3’。4.一种克隆草鱼补体C5基因的方法，其中，该方法步骤如下：(1)从草鱼肝脏中提取总RNA；(2)设计扩增草鱼补体C5基因保守结构域核...

【专利技术属性】
技术研发人员：许宝红，刘巧林，肖调义，赵玉蓉，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43