本发明专利技术涉及一种调控真核生物基因转录的DNA序列及其结合蛋白。本发明专利技术人首次从恶性疟原虫中鉴定和分离介导var基因家族转录沉默的非编码DNA序列及其结合蛋白——肌动蛋白。该DNA序列与肌动蛋白相互作用使var基因定位于细胞核周的异染色质区，导致基因沉默。并且，基于本发明专利技术的新发现，可筛选调节var基因转录、进而调节恶性疟原虫毒力的物质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种调控真核生物基因转录的DNA序列及其结合蛋白。
技术介绍
恶性疟原虫红细胞膜表面蛋白(PfEMPl)是var基因家族的编码产物，为恶性疟原虫最重要的毒力因子之一，介导被感染红细胞与宿主细胞受体黏附和免疫逃避等过程。var基因家族具有相互排斥性表达的特点，在约60个var基因中，一般只有其中一个基因获得表达。痕原虫在红细胞内的生活史循环中，该唯一表达的成员不断发生转换(Switching),导致高度的抗原变异。研究表明，该过程是在转录水平上进行调控所有var基因都位于细胞核周，沉默的基因位于异染色质区；活化的基因则位于常染色质。因此，var基因位点在细胞核周区域的定位是该过程的关键调控途径。但是，介导这一核周定位(Anchoring)的相关因子尚未有报导。所有var基因具有类似的结构两个外显子和一个内含子。其中，内含子序列高度保守。已有研究证实var基因的转录沉默与其内含子有关，内含子的缺失可导致相应var基因的转录激活。因此，内含子是var基因家族的重要调控序列，但是相应的作用因子(核蛋白)及其分子机制尚不清楚。鉴定参与var基因转录调控的内含子关键序列以及相关的结合蛋白，并研究它们的调控途径，不仅有助于阐明var基因家族的表达调控机制，而且为恶性疟原虫的防治提供潜在的药物靶点，具有重要的科学和应用意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得var基因内含子区域中关键核蛋白结合位点(iNBE)的DNA序列(寡核苷酸序列)、与该特征序列结合的核蛋白，以及iNBE/核蛋白复合物在var基因转录调控中所起的作用机制。本专利技术的目的还在于提供调控var基因转录的蛋白及调控方法，所述的蛋白是肌动蛋白。本专利技术的目的还在于提供筛选降低疟原虫毒力的潜在物质的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种寡核苷酸，所述的寡核苷酸选自⑴如下所示序列的寡核苷酸5’ AAAAA (TA) JCATAAAATAAAAA 3’ ；其中η =2-20(优选的，n = 3-9 ;如 3，4，5，6 或 7);或(ii)与(i)的寡核苷酸同源的变异体，具有与(i)的寡核苷酸相同的与蛋白质结合的能力。在一个优选例中，所述的寡核苷酸分离自恶性痕原虫(Plasmodiumfalciparum)var基因家族的内含子序列。 在另一优选例中，所述的寡核苷酸是分离的或人工合成的。在另一优选例中，所述的寡核苷酸是核蛋白的结合位点。在另一优选例中，所述的蛋白质是肌动蛋白；较佳地是I类肌动蛋白(ActinI)。在本专利技术的另一方面，提供所述的寡核苷酸的用途，用于特异性地与肌动蛋白相互作用。在另一优选例中，所述的肌动蛋白是I类肌动蛋白(Actin I)。在本专利技术的另一方面，提供肌动蛋白的用途，用于与var基因内含子相互作用(结合)，调控var基因的转录和表达。 在另一优选例中，所述的肌动蛋白选自(a)氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示的蛋白；(b)将SEQ ID NO 2氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；更佳地1_10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所述蛋白的功能的由(a)衍生的蛋白。在另一优选例中，所述的肌动蛋白由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列编码而成。在本专利技术的另一方面，提供一种复合物，包括所述的寡核苷酸以及肌动蛋白。在另一优选例中，所述的复合物是分离的。在另一优选例中，所述的复合物中，所述的寡核苷酸以及肌动蛋白相互作用(结合)。在本专利技术的另一方面，提供所述的复合物的用途，用于筛选抑制var基因转录水平、从而降低疟原虫毒力的物质。在本专利技术的另一方面，提供一种筛选降低疟原虫毒力的潜在物质的方法，所述方法包括用候选物质与所述的复合物接触，观察该复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况，若两者的相互作用增强，则表明其是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。在另一优选例中，所述方法包括(a)在测试组中，向包含权利要求4或5所述的复合物的体系中添加待筛选的候选物，并检测复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、包含权利要求4或5所述的复合物的体系中，检测复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况；(b)将步骤(a)测试组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用与对照组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用进行比较，如果测试组复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用在统计学上强于(优选显著强于，较佳的强20%或更强；更佳的强40%或更强；进一步更佳的强60%或更强)对照组，就表明该候选物是对于降低疟原虫毒力有用的潜在物质。在另一优选例中，通过免疫共沉淀法鉴定复合物中寡核苷酸以及肌动蛋白的相互作用情况。在另一优选例中，所述的肌动蛋白是游离的肌动蛋白(G-actin)。在本专利技术的另一方面，提供一种调控细胞内var基因的转录的方法，所述方法包括采用调节肌动蛋白聚合或解聚合的试剂处理细胞。在另一优选例中，所述的细胞是疟原虫的细胞。在另一优选例中，采用调节肌动蛋白解聚合的试剂处理细胞，调控细胞内var基因转录沉默，从而降低疟原虫的毒力；或采用调节肌动蛋白聚合的试剂处理细胞，调控细胞内Var基因转录激活。在另一优选例中，所述的调节肌动蛋白解聚合的试剂是Cytochalasin D(⑶)。在另一优选例中，所述的调节肌动蛋白聚合的试剂是Jasplakinolide(JAS)。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图I、恶性疟原虫var基因内含子的EMSA探针设计。自恶性疟原虫3D7株系基因组中扩增获得染色体中间位置var基因(PFDlOOOc)的全长内含子，并通过PCR分割成一系列片段重叠的短探针(5，端生物素标记)进行多轮的EMSA试验，最终的探针Cl. 2. 2即为iNBE序列ο图2、用EMSA试验鉴定var基因内含子核心结合序列(iNBE)。图示左侧为第一轮EMSA试验中，4条探针分别与恶性疟原虫3D7株核蛋白提取物的结果，其中int-a/b/c/d分别代表4条探针；N.E.代表恶性疟原虫核蛋白抽提物；C1、C2为初步鉴定到的不同的探针/核蛋白复合带。图示右侧以Cl. 2. 2 (iNBE)探针检测到特异性探针/核蛋白复合带，提示内含子核心结合序列所在位点。图3、竞争性EMSA验证iNBE结合复合物的特异性。恶性疟原虫核蛋白抽提物与竞争性DNA (无生物素标记DNA)相互作用的EMSA结果，以cl. 2. 2作为全部EMSA反应的特异探针；N. E.:核提取物，ssDNA :鲑鱼精DNA，酵母tRNA。图4、iNBE序列在3D7株基因组中的分布。图上部横坐标代表不同5’ UTR类型的var基因，纵坐标为3D7株不同Var基因内含子中的iNBE核心结合序列的拷贝数，图中每一个黑点代表一个内含子，共59个内含子。图5、免疫印迹分析Pfactin-I抗体的特异性。图示不同虫期阶段的恶性疟原虫抽提物分别与抗Pfactin-I抗体(鼠抗)进行免疫印记试验的结果，R、T、S分别代表3D7虫株的环状体、滋养体和裂殖体阶段。图6、超迁移试验(Super-shift)验证Pfactin-I与iNBE的相互作用。超本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘卫庆，张青锋，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：
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