细胞的冻存组合物和冻存方法技术

冻存细胞时，简便地进行添加来提高细胞的存活率。一种组合物，含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂，从即将冻存细胞到冻存细胞6小时前的期间，添加该组合物并使该组合物达到1容量％后保存细胞。该组合物会减少细胞遭受的冻害，由此可提高冻存时的细胞存活率，从而能够在不使用DMSO和血清的情况下保存细胞。并且，冻存细胞时也不需要对冻结速率进行精细的控制，是一种简便低廉的保存方法。

Cell cryopreservation compositions and cryopreservation methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞的冻存组合物和冻存方法
本专利技术涉及一种用于冻存细胞的冻存组合物和使用了该冻存组合物的冻存方法。
技术介绍
在防止传代导致的细胞转化、防止随传代产生的杂菌造成汚染、输送细胞等方面，细胞冻存是一种必需技术，其已得到广泛利用。但是，已知：在冻结细胞的过程中细胞内外的水分会形成冰结晶而对细胞造成损害(非专利文献1)。因此，期望：保护细胞在冻结、融化时不受损害，而且在维持细胞性质的状态下进行冻存。就普通的冻存而言，为了保护细胞不受由冰结晶引发的损害，一般采用下述做法：使细胞悬浮于添加有抗冻剂的含有牛血清等的培养液中，然后装入CryoTube(低温保存管)冻存管等中进行冷却，最终在－80℃或－196℃的极低温度下进行冻存。抗冻剂采用5～20％的二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Gly)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)等(专利文献1、2)。其中效果最高、最常用的是DMSO(非专利文献2)，但其并不能使细胞的保存率达到令人满意的结果，对冰结晶的抑制效果也不一定称得上充分。此外，有通过添加聚醚来增强DMSO的效果的方式(专利文献3)、通过使用果聚糖(Fructan)来提高细胞保护效果的方式(专利文献4)、通过配合羧化多聚赖氨酸开提高干细胞的保存效果的方式(专利文献5)，但冰结晶生成抑制效果都称不上充分。而且，聚醚的残留带来的细胞毒性令人担忧，需要有一种毒性更低的保存液。此外，果聚糖由于添加浓度高达30％而存在经济方面的问题、保存后难以除去的问题，羧化多聚赖氨酸的细胞保存仅着眼于干细胞，因此通用性差，且由于是多肽，对细胞的功能性的影响令人担忧，等等，出于上述原因，上述做法对细胞的保存效果并不一定令人满意。因此，需要一种能够保存任何细胞的低毒性的保存液。专利文献1：日本专利第5940975号专利文献2：日本公开专利公报特开2001－247401号专利文献3：日本公开专利公报特表平10－511402号专利文献4：日本公开专利公报特开2012－235728号专利文献5：日本专利第5630979号专利文献6：日本公开专利公报特开2016－160244号非专利文献1：Mazur，Am.J.Physiol.，247：C125－142，1984非专利文献2：KovelockJEandBioshopMWH，Nature183：1394－1395，1959
技术实现思路
－专利技术要解决的技术问题－就现有的冻存法而言，对冰结晶的生成抑制效果不充分，保护细胞不受冻害影响的效果不充分，因此需要开发一种毒性较低的新型冻存剂。－用以解决技术问题的技术方案－本专利技术的专利技术人为解决上述问题而进行了潜心研究。其结果是，发现了：槐糖脂(SL)具有抑制冰结晶生成的效果，能够简便地抑制冻害对细胞的损害。利用这一点，发现了：通过向冻存前的细胞培养液中添加0.01重量％到20重量％的SL，能提高细胞的保存效率。还发现了：冻结细胞时，若添加0.01重量％到20重量％的SL，则能缓和DMSO的毒性。而且发现了：通过向0.01重量％到20重量％的SL中添加1重量％到50重量％的多元醇，能在不添加DMSO的情况下提高保存后的细胞存活率。即，本专利技术提供以下技术方案。[1]一种组合物，其中，含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂(sophorolipid)，且用于提高冻存后的细胞存活率。[2]根据[1]所述的组合物，其中，含有5重量％到10重量％的二甲基亚砜(DMSO，Dimethylsulfoxide)。[3]根据[1]或[2]所述的组合物，其中，含有1重量％到50重量％的多元醇。[4]根据[3]所述的组合物，其中，作为多元醇，包括甘油、乙二醇、丙二醇中的至少一者。[5]一种冻存细胞的方法，其中，从即将冻存细胞到冻存细胞6小时前的期间，向细胞培养基中添加[1]所述的组合物并使该组合物达到1容量％，来冻存细胞。[6]一种冻存细胞的方法，其中，在冻存细胞时，向细胞培养基中添加[2]到[4]所述的组合物并使该组合物达到10容量％到99容量％，来冻存细胞。－专利技术的效果－通过添加SL，能够减少细胞遭受的冻害。其结果是，不依赖DMSO和血清的效果就能够实现一定水准以上的细胞存活率。附图说明图1是冰晶形成抑制情况的显微镜图片，其中，(A)为超纯水，(B)为10重量％SL，(C)为0.1重量％SL，(D)为10重量％DMSO，(E)为10重量％Gly，(F)为10重量％PG，(G)为10重量％EG，(H)为10重量％APG。图2示出细胞标记的表达情况。图3是细胞形态的显微镜图片，其中，(A)为0.2重量％SL+30重量％Gly，(B)为0.2重量％SL+20重量％Gly，(C)为0.2重量％SL+15重量％Gly，(D)为0.1重量％SL+30重量％Gly，(E)为0.1重量％SL+20重量％Gly，(F)为0.1重量％SL+15重量％Gly，(G)为0.05重量％SL+30重量％Gly，(H)为0.05重量％SL+20重量％Gly，(I)为0.05重量％SL+15重量％Gly，(J)为30重量％Gly，(K)为20重量％DMSO。具体实施方式SL是低毒性的糖脂类生物表面活性剂，是通过酵母发酵得到的发酵产物。可认为：通过在冻结细胞前添加SL(事先添加)，SL就会被摄入细胞内，能发挥抑制细胞内的冰形成结晶的效果，通过在冻结时添加SL能发挥抑制细胞外的冰形成结晶的效果。在下述实验例、实施例中使用的SL是按照日本公开专利公报特开2016－160244号公报的记载调配而成的。需要说明的是，作为SL，使用了将pH调节为6～8而成的物质。pH调节剂例如有碱剂、酸等。多元醇有甘油、乙二醇、丙二醇等，优选为丙二醇。细胞保存液的细胞是动植物细胞。例如有体细胞、癌细胞、株化细胞、干细胞等。此外，同样还适用于由细胞构成的组织、器官、动植物等的个体。在植物性食品和植物性食品的鲜度保持方面很有前景。使用了本专利技术的冻结、融化方法没有特别限定，冻结时不用进行精细的温度控制，通过普通的缓慢冻结、快速融化也能够实现。[实验例冰结晶抑制组合物和冰晶生成抑制效果]在细胞保存时最通用的培养基即Dublecco改良培养基(DMEM)中，将表1的组合物以7∶3的容量比混合。取各试样15mL并分别加入离心管(ThermoScientificBioLite)，依次在4℃的条件下冷却5分、在-20℃的条件下冷却20分、在-80℃的条件下冷却，以-80℃冷却10分钟后，目视观察了试样的外观。[表1]组成冰结晶抑制效果实验例133重量％SL○实验例20.033重量％SL○实验例333重量％APG○实验例40.033重量％APG○实验例5蒸馏水或超纯水×实验例633重量％DMSO△○：未观察到冰的结晶△：观察到较小的冰的结晶×：观察到较大的冰的结晶APG：烷基聚糖苷*(*PLANTACARE2000UP，BasfJapanLtd.)根据表1的结果，与实验例5、6相比，实验例1～4的冰结晶生成抑制效果更佳。以达到表2的组成的方式，用超纯水进行了调配。将各试样在扫描探针显微镜(AFM5000/AFM5300，HitachiHigh-TechScienceCorporation)的冷却台上冻结后，用光学显微镜进行观察。本试验是在大阪大学纳米技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其特征在于：含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂，且用于提高冻存后的细胞存活率。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.31 JP 2017-0162661.一种组合物，其特征在于：含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂，且用于提高冻存后的细胞存活率。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：含有5重量％到10重量％的二甲基亚砜(DMSO)。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于：含有1重量％到50重量％的多元醇。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于：作为多元醇，包括甘油、乙二醇、丙二醇中的至少一者。5.一种组合物，其特征在于：含有槐糖脂和多元醇，不...

【专利技术属性】
技术研发人员：野上明日香，龙见宗树，石井七濑，竜瑞之，平田善彦，泽芳树，宫川繁，斋藤充弘，大河原弘达，
申请(专利权)人：莎罗雅株式会社，国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP