一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术制造技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术，所述方法包括弱毒株冻干保护剂、复苏液制备方法和复苏技术。本发明专利技术的罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种及复苏技术能保持无乳链球菌弱毒株免疫活性，且冻干保护剂配方和复苏液成分简单，成本低，易配制，利于长期保存，本发明专利技术为今后广泛使用罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗提供前期基础。

Freeze-drying Preservation and Resuscitation Technology of an Attenuated Streptococcus Lactarius Strain from Tilapia

【技术实现步骤摘要】
一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术
本专利技术涉及菌株冻干保存及复苏技术，具体涉及罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术。
技术介绍
链球菌病是罗非鱼养殖业最为严重的病害之一，每年造成巨大经济损失。我国是罗非鱼养殖大国，每年因链球菌病给水产养殖造成直接经济损失约10亿美元。自2001年开始，中国罗非鱼养殖陆续出现了链球菌病感染，并在个别养殖场造成30-50%高死亡率，按我国罗非鱼年均产量计算，估计每年链球菌病给我国罗非鱼产业造成直接经济损失超过5亿美元。药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，随着耐药和抗药性的产生和积累，病害暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约罗非鱼产业发展的瓶颈。疫苗是有效控制该病发生方法之一。自1995年以色列学者EldarA报道通过免疫接种预防罗非鱼链球菌病开始，美国（Klesius等,1999;Pridgeon等,2011）、中国（Sun等,2010）、日本(Dumronghol等,2009)和韩国(Shin等，2007)等国家多个实验室先后开展了罗非鱼链球菌病灭活疫苗研究，并在试验室取得很好免疫效果。但由于研制的灭活疫苗只能激发鱼体的体液反应而无法提供有效免疫应答，并只能通过注射方法达到防治效果，操作不方便，因此灭活疫苗一直未能在生产上推广使用。而弱毒疫苗具有免疫剂量低、免疫效果好、保护期长等特点，且可以在鱼体内短暂停留，诱导体内体液反应和细胞反应，然后在体内自行消失。美国Pridgeon等通过抗生素筛选方法获得了海豚链球菌和无乳链球菌弱毒株；Huang等利用基因工程技术获得基因重组弱毒疫苗，它们免疫试验都证明了弱毒疫苗具有较高免疫保护率。本实验室前期通过温差传代快速培养方法获得一株无乳链球菌弱毒株YM001，该弱毒株具有良好安全性和免疫原性，注射免疫后第15d相对免疫保护率为96.88%，30d相对免疫保护率为93.61%，对罗非鱼链球菌病的防治具有巨大开发价值。虽然弱毒株具有良好免疫原性，但是其在常温下活力差，不易于长期保存。而冷冻干燥是保存细菌最方便和最成功方法之一，能使保存细菌不易受污染，可长期存放，易于分装和再复苏使用，而目前关于无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法未见相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于找到一种能保持罗非鱼源无乳链球菌弱毒株具有良好稳定性和免疫原性方法，且便于长期保存，为今后推广应用无乳链球菌病弱毒疫苗提供前期基础研究。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存方法，其特征在于包括以下内容：（1）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法所述无乳链球菌弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCCM2014045，保藏日期2014年2月26日，生物材料样品分类命名:无乳链球菌YM001Streptococusagalactiae。（2）将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株YM001扩大培养；（3）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种的冻干保护剂包括：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%组成，余量为水，116℃灭菌30min，获得冻干保护剂；（4）将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株与冻干保护剂按照7:1比例混合，进行冻干，获得冻干无乳链球菌弱毒株。罗非鱼源无乳链球菌冻干弱毒株复苏技术，其特征在于：复苏液为水，复苏后冻干弱毒株稳定性及免疫原性未发生改变。具体地：（1）罗非鱼弱毒株扩大培养将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株YM001，先划线接种至血平板培养。挑单个菌落接种于改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖）培养，获得种子液。将培养种子液按1.0%接种量接入装改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖）中培养，离心，弃上清，留沉淀物。（2）罗非鱼无乳链球菌弱毒株冻干保护剂筛选对蔗糖、明胶、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）不同组合及比例与YM001进行冻干。（3）根据步骤（2）冻干前后细菌数变化最少，筛选获得最佳冻干保护剂，与罗非鱼源无乳链球菌弱毒株以1:7比例混合后，将弱毒株按照合适冻干曲线进行冻干。（4）冻干后弱毒株物理性状观察冻干后弱毒株物理性状观察包括弱毒株颜色、冻型、是否易与瓶壁脱离性、溶解性等。（5）冻干弱毒株复苏液筛选用水、PBS（磷酸缓冲盐溶液）、1%生理盐水及马丁培养基四种溶液对冻干弱毒株进行复苏，以冻干前后细菌数变化少，作为弱毒株冻干复苏液。（6）冻干弱毒株安全性测定将冻干弱毒株注射罗非鱼，进行安全返毒试验，连续盲传5代。观察注射后鱼死亡情况，测定其安全性。（7）冻干弱毒株免疫原性测定取保存180d、360d、540d冻干弱毒株注射罗非鱼，在免疫后第15d、30d、60d各用强毒株HN016进行腹腔注射感染，每次注射20尾，设立对照组。攻毒后饲养观察20d，每天记录试验鱼发病及死亡情况，并用血平板对死亡实验鱼脑和肝组织进行细菌分离鉴定，并计算相对免疫保护率。相对免疫保护率（RPS）=（对照组死亡率-免疫组死亡率）/对照组死亡率。本专利技术所具有优点：本专利技术的菌株冻干保种方法操作简单、实用性强，安全、稳定，能很好保持弱毒菌株免疫原性，复苏液能恢复弱毒株冻干前活性，并且本专利技术的冻干保护剂配方和复苏液成分简单，成本低，易配制，该方法为今后成功研制罗非鱼无乳链球菌疫苗奠定基础。具体实施方式实施例1无乳链球菌弱毒株复苏、扩大培养本专利技术所用弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCCM2014045。将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株YM001，划线接种至5%血平板，28℃培养24h。挑单个菌落接种于100mL改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖），28℃振荡培养12h。将培养12h的种子液按1.0%接种量接入装2L改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖）中，35℃培养24h后，离心5min，10000×g。弃上清，留沉淀物。吸取菌液100µl到50mLPBS中混匀，从混合液中吸取100µl的菌液至另一个50mL的PBS中混匀，最后吸取100µl的菌液到血平板中均匀涂布，设三个平行，取三者平均值，计算出冻干前弱毒株活菌总数CFU。存活率计算公式：存活率(％)=冻干后活菌数（每瓶）／冻干前活菌数×100实施例2冻干保护剂筛选先将四种保护剂按照下述比例各配制100ML，116℃灭菌30min，待用。保护剂Ⅰ：蔗糖40%、明胶12%；保护剂Ⅱ：蔗糖40%、明胶12%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%；保护剂Ⅲ：蔗糖40%、脱脂奶粉10%；保护剂Ⅳ：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%。用PBS调整菌液体积至84mL，平均分装至12个10mL的冻干瓶中，计算冻干前活菌数。再按菌液与最佳保护剂7:1比例在冻干瓶中分别加入保护剂Ⅰ-Ⅳ，对照组不添加保护剂，每个试验组均设三个平行，冻干后细菌数计算取三者平均值。按-4℃进箱，-40℃维持约2h，板层由-40℃升至-5℃，维持20h，板层温度提高到28℃，维持8h，全程约32h。结束后压盖，打开真空阀，结束冻干过程。完成后用超纯水溶解，分别检测4种不同保护剂冻干后所含活菌数CFU。采用SPSS17.0Duncan方法单因素方差进行分析，P<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存方法，其特征在于包括以下内容：（1）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法所述弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC M 2014045；（2）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种的冻干保护剂包括：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%组成，余量为水，116℃灭菌30 min，获得冻干保护剂；（3）将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株与冻干保护剂按照7:1比例混合，进行冻干，获得冻干无乳链球菌弱毒株。

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存方法，其特征在于包括以下内容：（1）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法所述弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCCM2014045；（2）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种的冻干保护剂包括：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明，李莉萍，黄婷，刘宇，梁万文，唐佳有，王瑞，李健，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：广西,45