一种分离外泌体的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离外泌体的方法，该方法首先将微球与结合试剂、待分离的外泌体样本混合、孵育，形成微球‑外泌体复合物；去除未被微球吸附的上清，然后将微球‑外泌体复合物分散到洗脱液中，将外泌体从微球表面洗脱；去除微球，即为纯化得到的外泌体。本发明专利技术的方法分离得到的外泌体纯度高、得率高，且操作便捷、分离快速。

A Method for Isolating Exosomes

【技术实现步骤摘要】
一种分离外泌体的方法
本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种分离外泌体的方法。
技术介绍
外泌体是指由细胞分泌的，粒径在30-150nm之间小膜泡，其可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。几乎所有细胞都会分泌外泌体，血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中都能够提取到外泌体(PNAS105(2008)10513-10518)。通过对体液中外泌体的提取，检测外泌体中携带的生物分子，可以方便快捷地监测疾病的发生发展过程。而通过文献调研我们可知，上述外泌体的下游应用都取决于提取得到的外泌体品质，即外泌体的纯度和得率，即获得更高纯度和更高得率的外泌体样本是成功实现外泌体下游应用的关键因素。现有的外泌体分离方法种类很多，经典的外泌体分离方法是超速离心法，超速离心法是基于外泌体与其他生物组份密度的微小差异进行分离，该方法分离得到的外泌体纯度较高，但是损失较大，得率较低，同时还要借助昂贵的大型仪器，分离纯化外泌体的效率较低。另一类是通过在微球表面固定与外泌体表面的特定蛋白结合的抗体，通过免疫亲和作用提取样本中的外泌体，该方法虽然操作相对简单，但由于所用抗体种类有限，因此只能提取部分外泌体，即外泌体种类的完整性不足，且回收率亦不能令人满意，此外由于采用抗体与外泌体表面抗原结合的方式进行外泌体的分离纯化，干预了外泌体表面的免疫特性，有可能影响其下游的应用。此外还有基于亲水性聚合物沉淀的方法提取外泌体(如文献ScientificReports2016,6,23978，专利CN107523536A)，但分离到的外泌体中夹杂有大量的非外泌体来源蛋白，外泌体纯度极低。因此，目前还未有一种方法可简单有效地同时实现高得率和高纯度的外泌体分离，急需开发一种简单高效的外泌体分离方法。
技术实现思路
本专利技术公开了一种分离外泌体的方法，该方法包括如下步骤：首先将微球与结合试剂、待分离的外泌体样本混合、孵育，形成微球-外泌体复合物；去除未被微球吸附的上清，然后将微球-外泌体复合物分散到洗脱液中，将外泌体从微球表面洗脱；去除微球，即为纯化得到的外泌体。具体的说，本专利技术的一种分离外泌体的方法，包括如下步骤：(1)构建反应体系：将微球、结合试剂和预处理后的样品混匀；(2)孵育：将混匀后的反应体系在0-30℃下静置或混匀孵育10min～4h；然后去除上清液，得到微球-外泌体复合物；(3)洗脱：加入洗脱液，并将微球-外泌体复合物均匀分散于洗脱液中，洗脱微球上吸附的外泌体；然后去除微球，所得的上清液即为包含外泌体的溶液。其中步骤(1)中，微球粒径在100nm-30μm，表面带有亲水性功能基团，所述的亲水性功能基团为羧基、氨基、羟基或两性离子；微球可通过自行合成或购买商品化试剂盒得到；微球可含有磁性，也可不含磁性；含有磁性的微球可用磁吸附方式分离，不含磁性的微球可用100-3000g离心进行分离；结合试剂由亲水性聚合物、盐和pH缓冲液组成；其中亲水性聚合物为聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酰胺、葡聚糖、聚乙烯亚胺或聚乙烯吡咯烷酮、两性甜菜碱类化/聚合物的中的一种或多种；优选的亲水性聚合物为PEG，分子量在2000～12000；进一步优选的，PEG的分子量为8000；其中盐为钾盐或钠盐，优选的为钠盐，更具体的说是NaCl；其中pH缓冲液为：PBS、Tris-HCl、柠檬酸盐缓冲液等，优选的为PBS；样本为细胞培液以及血浆、血清、脑脊液、淋巴液、乳汁、尿液或唾液等各种任意含有外泌体的液体样本；其中预处理后的样本，是指将样本经过低速差速离心，然后过滤的预处理；具体的说，对样本的预处理为：对样本进行低速差速离心，包含300g离心5min、2000g离心10min和10000g离心30min步骤；离心之后，用0.22μm滤膜的过滤以去除较大的杂质；其中步骤(2)中，微球的工作浓度为0.01mg/ml-3mg/ml；亲水性聚合物的工作浓度在30mg/ml-200mg/ml；盐的工作浓度范围在0.01-2M；其中步骤(3)中，洗脱液为PBS、Tris-HCl、柠檬酸盐缓冲液或去离子水；更具体的说，本专利技术的一种分离外泌体的方法，包括如下步骤：(1)构建反应体系：将微球、结合试剂和预处理后的样品混匀；(2)孵育：将混匀后的反应体系在0-30℃下静置或混匀孵育10min～4h；然后去除上清液，得到微球-外泌体复合物；(3)洗脱：加入洗脱液，并将微球-外泌体复合物均匀分散于洗脱液中，洗脱微球上吸附的外泌体；然后去除微球，所得的上清液即为包含外泌体的溶液；(4)二次分离纯化：步骤(3)得到的外泌体溶液作为第二次分离纯化的样本，重复步骤(1)-(3)，得到所需的包含外泌体的溶液。通过二次分离纯化，可以提高所得外泌体溶液中的外泌体纯度。其中上述步骤(1)对样本预处理的目的是去除其中的细胞碎片和其他较大的杂质，利于纯化外泌体；其中样本可以是新鲜的或者在-20℃及以下温度冻存的；冻存的样品在使用前，需在室温下复溶；对于蛋白和外泌体浓度较低、体积较大的细胞培液，为提高处理效率、减少试剂用量，可在预处理后用100KD超滤管进行浓缩处理，可进行10-50倍浓缩。本专利技术解决的技术问题是：利用亲水性聚合物竞争溶液中的水分子，大量的亲水性聚合物存在条件下，使得外泌体脱水而析出，在析出过程中由于溶液中存在大量的微球，外泌体会优先吸附于微球表面，之后通过洗脱液将外泌体从微球表面脱附下来，从而实现样品中外泌体的快速稳定提取。该技术解决了现有的外泌体分离方法无法同时实现分离得率高和外泌体纯度高两个要素的难点，具有简单易操作、分离时间短、分离得到的外泌体纯度高、得率高、表面性状保存完整等优点，后续可与自动化分离装备联用，实现外泌体的全自动分离与纯化。本专利技术提供的一种分离外泌体的方法，通过亲水性聚合物和微球，能够吸附大量的外泌体，且吸附在微球表面的外泌体可以被快速简单地洗脱下来。本专利技术的方法分离得到的外泌体产率高，且获得的外泌体中的RNA含量与蛋白种类也高于经典的超速离心方法。本专利技术的方法适用于多种细胞培液以及血浆、脑脊液、尿液、乳液、淋巴液或唾液等任意含有外泌体的液体样本，且有利于小体积样品的外泌体分离。通过联用亲水性聚合物和微球，可以在方便快捷地分离得到较高纯度外泌体的同时，有效去除样品中游离蛋白等杂质对外泌体下游应用的干扰。此外，通过重复提取步骤，可得到纯度与超离方法接近的外泌体，且得率是超离方法的4倍以上。该方法提取得到的外泌体，可以有效用于下游分析与研究，包括WesternBlot鉴定、RNA分析和蛋白质谱表征，相关的蛋白、核酸标志物测定，细胞间相互作用的机理探究等。附图说明：图1：基于微球和PEG试剂提取外泌体方法的示意图。图2：实施例1提取细胞培液外泌体的回收率和纯度结果。图3：TEM表征实施例1中提取A549细胞培液外泌体。图4：TEM表征实施例1中提取293T细胞培液外泌体。图5：实施例1中外泌体Westernblot的结果。图6：实施例2提取血浆外泌体的回收率和纯度结果。图7：TEM表征实施例2中提取到的外泌体。图8：TEM表征密度梯度离心法提取到的外泌体。图9：实施例2中Westernblot显示的蛋白结果。图10：不同孵育时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离外泌体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：首先将微球与结合试剂、待分离的外泌体样本混合、孵育，形成微球‑外泌体复合物；去除未被微球吸附的上清，然后将微球‑外泌体复合物分散到洗脱液中，将外泌体从微球表面洗脱；去除微球，即为纯化得到的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种分离外泌体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：首先将微球与结合试剂、待分离的外泌体样本混合、孵育，形成微球-外泌体复合物；去除未被微球吸附的上清，然后将微球-外泌体复合物分散到洗脱液中，将外泌体从微球表面洗脱；去除微球，即为纯化得到的外泌体。2.根据权利要求1所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)构建反应体系：将微球、结合试剂和预处理后的样品混匀；(2)孵育：将混匀后的反应体系在0-30℃下静置或混匀孵育10min～4h；然后去除上清液，得到微球-外泌体复合物；(3)洗脱：加入洗脱液，并将微球-外泌体复合物均匀分散于洗脱液中，洗脱微球上吸附的外泌体；然后去除微球，所得的上清液即为包含外泌体的溶液。3.根据权利要求2所述的分离外泌体的方法，其特征在于：其中步骤(1)中，微球粒径在100nm-30μm，表面带有亲水性功能基团，所述的亲水性功能基团为羧基、氨基、羟基或两性离子。4.根据权利要求2所述的分离外泌体的方法，其特征在于：其中结合试剂由亲水性聚合物、盐和pH缓冲液组成；其中亲水性聚合物为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖、聚乙烯亚胺或聚乙烯吡咯烷酮、两性甜菜碱类化/聚合物中的一种或多种；其中盐为钾盐或钠盐，优选的为钠盐，更具体的说是NaCl；其中pH缓冲液为：PBS、Tris-HCl或柠檬酸盐缓冲液。5.根据权利要求4所述的分离外泌体的方法，其特征在于：亲水性聚合物为聚乙二醇，分子量在2000～12000。6.根据权利要求5所述的分...

【专利技术属性】
技术研发人员：古宏晨，刘冰，徐宏，方晓霞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海,31