一种数字PCR芯片及其制备方法技术

一种数字PCR芯片及其制备方法，该数字PCR芯片包括：基片(11)，该基片(11)一表面设有微孔结构(12)阵列，所有微孔结构(12)均不贯穿该基片(11)；金属膜层(13)，其形成于每个微孔结构(12)内表面的局部区域或全部区域，基片(11)表面除微孔结构(12)的其它区域无金属膜层(13)，该金属膜层(13)具有高反射率。该芯片能够大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。

A Digital PCR Chip and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
一种数字PCR芯片及其制备方法
本专利技术涉及DNA检测领域，尤其涉及一种数字PCR芯片及其制备方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。PCR技术以其指数扩增的特点，可短时内将目标DNA扩增百万倍；以其简便易行、灵敏度高的优点，被广泛应用于基础科学和临床研究。随着生命科学和医学检测的不断发展，研究者们越来越希望在保留PCR反应的特异性、灵敏性、保真度的同时，能尽量的缩短检测时间，实现快速定量和检测。因此，自传统PCR技术被专利技术以来，出现了多种半定量、定量、以及各种以快速检测为目的PCR检测方法(逆转录PCR、原位PCR、实时PCR等)，在大批量样本检测和疾病早期快速诊断等方面获得重要应用。数字PCR(digitalPCR，dPCR)不依赖标准曲线，是仅根据一次反应即可确定目标DNA数量的绝对定量技术。微孔式dPCR具有固相载体，即微孔dPCR芯片。其原理是利用微流控技术，将PCR预混液均匀导入芯片微孔进行大量分割，使得每个反应单元中目标DNA分子数为0或1。PCR反应后，具有一个DNA分子的微孔内产生特异性的阳性荧光信号。使用荧光成像仪或者荧光显微镜检测荧光信号，并用图像处理软件统计和分析即可得到目标DNA分子拷贝数(即目标物浓度)。由于dPCR每个微孔体积多数情况是皮升量级，因此，其荧光信号检测时，孔内荧光分子数少，且荧光强度弱。从定量角度而言，微孔式dPCR已经是绝对定量技术，优于所有已知的PCR衍生技术。从快速检测的角度，一方面dPCR系统仍然依赖外部热循环，提高升降温速率可缩短检测时间；另一方面，对dPCR荧光信号进行放大或者采用更加灵敏的成像系统，可降低dPCR反应所需循环数，缩短反应时间，达到快速检测目的。然而，基于上述以快速检测为目的dPCR技术，多集中在改善温度控制、CCD灵敏度、光路系统、荧光分子设计等外部设备和试剂方面，很少有针对芯片本身的设计。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题针对于现有的技术问题，本专利技术提出一种数字PCR芯片及其制备方法，用于解决现有技术中荧光信号检测时，荧光分子数少和荧光强度弱等问题。(二)技术方案本专利技术提供一种数字PCR芯片，包括：基片11，基片11一表面设有微孔结构12阵列，所有微孔结构12均不贯穿基片11；金属膜层13，其形成于每个微孔结构12内表面的局部区域或全部区域，基片11表面除微孔结构12的其它区域无金属膜层13。可选地，金属膜层13的材质为金、铜、钼、铝、银或金属氧化物。可选地，金属膜层13的厚度为5-2000nm。可选地，单个微孔结构12的宽度为5-2000μm，深度为5-1000μm。可选地，单个微孔结构12的宽度与深度的比值大于1。可选地，微孔结构12的孔形状为圆形或n边形，其中，n≥3。可选地，基片11的材质为硅、金属或固体有机材料。可选地，金属膜层13形成于每个微孔结构12的底面。可选地，金属膜层13形成于每个微孔结构12的侧壁。本专利技术另一方面提供一种PCR芯片的制备方法，包括：S1，在基片11表面旋涂光刻胶，对光刻胶进行紫外光刻，得到刻蚀图案；S2，按照刻蚀图案刻蚀基片11，得到微孔结构12阵列；S3，在所有微孔结构12内表面局部区域或全部区域蒸镀金属膜层13，清洗光刻胶，得到数字PCR芯片。(三)有益效果本专利技术提出一种数字PCR芯片及其制备方法，有益效果为：1、该芯片表面的微孔结构(荧光信号区域)内表面局部区域或全部区域设有高反射率的金属膜层，除微孔结构的其它区域(非信号区域)无高反射率的金属膜层。通过该种芯片设计方式，其一，可使入射照明光在微孔中多次反射，提高微孔溶液中荧光分子被激发的机会；其二，使处于微孔溶液中被激发的荧光信号在微孔金属膜层的作用下，提高反射，降低微孔侧壁和底面对荧光的吸收；其三，由于芯片上表面不具有膜层，并不提高荧光背景，对荧光信号具有特异性的增强作用；其四，该芯片用于检测微孔阵列内部反应溶液的荧光强度，不仅仅局限于芯片表面，使得金属膜层表面无需进行生物分子化学修饰，可最大程度的增强荧光信号；其五，可降低微孔溶液中荧光信号的漫反射。基于上述五个方面，大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。2、芯片的微孔阵列可对微升量级dPCR反应预混溶液进行高通量分割，使每个微孔里的溶液体积可达飞升～皮升量级(根据微孔尺寸)。附图说明图1示意性示出了本专利技术实施例数字PCR芯片的俯视和剖面结构示意图。图2示意性示出了本专利技术实施例数字PCR芯片的制备工艺流程图。图3示意性示出了采用本专利技术实施例数字PCR芯片测量DNA分子浓度的荧光增强作用示意图。图4示意性示出了采用本专利技术实施例数字PCR芯片测量DNA分子浓度的荧光信号增强作用的实验结果图。图5示意性示出了采用本专利技术实施例数字PCR芯片测量DNA分子浓度的荧光值与循环次数的曲线图。【附图标记】11-基片111-基片上表面12-微孔结构121-阳性微孔结构122-阴性微孔结构13-金属膜层14-光刻胶15-掩膜版16-紫外光具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术进一步详细说明。本专利技术针对于芯片本身的设计，提出一种数字PCR芯片及其制备方法，用于检测DNA分子浓度。该芯片在检测DNA分子浓度时，可大幅度增强特异性的阳性荧光信号强度，提高信噪比，在较低循环数条件下即可实现荧光信号检测，极大地缩短检测时间，提高检测效率。实施例1本实施例提出一种数字PCR芯片，具体包括：基片11，该基片11一表面设有微孔结构12阵列，所有微孔结构12均不贯穿该基片11，如图1中上图所示。基片11的材质为硅、金属或耐高温的固体有机材料，具有良好的导热性能。进一步的，单个微孔结构12的宽度为5-2000μm，深度为5-1000μm，其宽度与深度的比值大于1。通过对微孔结构12不同宽度和深度的设计，形成不同的反应体积，可对微升量级dPCR反应预混溶液进行高通量分割，使每个微孔里的溶液体积可达飞升～皮升量级(根据微孔尺寸)，并且每个微孔包含目标DNA分子数不大于1个。进一步的，该微孔结构12的孔形状为圆形或n边形，其中，n≥3。金属膜层13，其形成于每个微孔结构12内表面的局部区域或全部区域，该基片11表面除微孔结构12的其它区域无金属膜层13。该金属膜层13可形成于每个微孔结构12的底面，可形成于每个微孔结构12的侧壁，也可形成于每个微孔结构12的底面及侧壁。进一步的，金属膜层13的材质为金、铜、钼、铝、银等高反射率金属或金属氧化物，厚度为5-2000nm。通过在微孔结构12内表面形成金属膜层13，并选取合适的材料及厚度，使得该芯片在检测DNA分子浓度时，具有如下优势：其一、可使入射照明光在微孔中多次反射，提高微孔溶液中荧光分子被激发的机会；其二，使处于微孔溶液中被激发的荧光信号在微孔金属膜层的作用下，提高反射，降低微孔侧壁和底面对荧光的吸收；其三，由于芯片上表面不具有金属膜层，并不提高荧光背景，对荧光信号具有特异性的增强作用；其四，该芯片用于检测微孔阵列内部反应溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种数字PCR芯片，包括：基片(11)，所述基片(11)表面设有微孔结构(12)阵列，所述微孔结构(12)不贯穿所述基片(11)；金属膜层(13)，其形成于所述微孔结构(12)内表面的局部区域或全部区域，所述基片(11)表面除微孔结构(12)的其它区域无所述金属膜层(13)。

【技术特征摘要】
1.一种数字PCR芯片，包括：基片(11)，所述基片(11)表面设有微孔结构(12)阵列，所述微孔结构(12)不贯穿所述基片(11)；金属膜层(13)，其形成于所述微孔结构(12)内表面的局部区域或全部区域，所述基片(11)表面除微孔结构(12)的其它区域无所述金属膜层(13)。2.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，所述金属膜层(13)的材质为金、铜、钼、铝、银或金属氧化物。3.根据权利要求1或2所述的数字PCR芯片，所述金属膜层(13)的厚度为5-2000nm。4.根据权利要求1所述的数字PCR芯片，单个微孔结构(12)的宽度为5-2000μm，深度为5-1000μm。5.根据权利要求4所述的数字PCR芯片，单个微孔结构(12)的宽度与深度的比值大于1。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文文，节俊尧，胡诗铭，蒋莉娟，魏清泉，俞育德，
申请(专利权)人：中国科学院半导体研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11