一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其能解决现有疫苗的效力检测方法费时费力，并且需要免疫的技术问题。一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。该试剂盒将疫苗中蛋白含量与对照样品进行比较，无需对试验动物进行免疫。

An ELISA Antigen Detection Kit for Porcine Circovirus 2 and Its Detection Method

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及检测试剂盒
，具体涉及一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Procinecircovirustype2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原。PMWS主要发生在5-12周龄的断奶仔猪，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。病原学及血清学调查研究表明，该病在许多国家广泛存在，给养猪业造成严重的经济损失。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种单股共价闭合环状DNA病毒，基因组含有1766～1768nt，结构简单，主要含有2个阅读框架(ORFs)：ORF1编码病毒复制相关蛋白Rep和Rep’，参与病毒复制；ORF2编码病毒衣壳蛋白Cap，是病毒的结构蛋白，与病毒的致病性和免疫原性有关。目前，疫苗免疫接种被认为是防控猪圆环病毒病的有效手段，商品化疫苗的推广应用为有效防控中国PCV2疫情发挥了重要作用。国内商品化PCV2疫苗众多，疫苗的效力检测一般采用免疫攻毒法，该方法经典却耗时耗力，而且动物免疫是必不可少的环节。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其能解决现有疫苗的效力检测方法费时费力，并且需要免疫的技术问题。一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；所述包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；所述对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，所述猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。进一步的，所述猪圆环病毒2型灭活培养物由以下方法制得：将猪圆环病毒2型毒种接种于PK细胞的培养瓶中，置37℃下吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃下旋转培养，转速为10～12转/小时，培养4日后，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定，将检验合格的病毒液加入β-丙酰内酯灭活，使其终浓度为0.1％，随即充分混匀，4℃20小时，37℃振摇2小时，得到所述猪圆环病毒2型灭活培养物。进一步的，所述猪圆环病毒2型抗原的包被浓度为0.05-5μg/ml，包被稀释液为0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液。进一步的，所述阳性质控血清为所述猪圆环病毒2型全病毒蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔后采集血清，经MABSELECT纯化所得，稀释比例为1:1000-1:4000；所述阴性质控血清为健康新西兰大白兔的血清经MABSELECT纯化后所得，稀释比例为1:50-1:500。进一步的，所述酶标二抗为HRP-羊抗兔(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)，稀释浓度为1:1000-1:20000，稀释液为含有0.1-5％(W/V)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(V/V)ProClin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。进一步的，所述样品稀释液为含有0.1-5％(W/V)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(V/V)ProClin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。进一步的，所述洗涤液为10倍的浓缩洗涤液，所述10倍的浓缩洗涤液为含有0.5％(V/V)吐温-20的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。进一步的，所述显色液为TMB底物显色液。进一步的，所述终止液为2mol/L的H2SO4。本专利技术还提供了上述ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)向包被板分别加入1：2稀释的待检样品、1：2稀释的对照样品各一列，每孔50μl；(2)向包被板剩余列中分别加入1:2稀释的阴性质控血清一列、1:2稀释的阳性质控血清一列，作为对照，每孔100μl；(3)向包被板的待检样品、对照样品列中加入阳性质控血清，每孔50μl，盖好包被板；(4)包被板置37℃反应1小时；(5)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子；(6)每孔加入100μ1辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，酶标板置37℃反应1小时；(7)倒掉孔内液体，用洗涤液洗涤3～5次，每孔300μ1，最后一次洗涤后拍干板子；(8)每孔加入100μ1TMB底物显色液，室温显色15分钟；(9)每孔加入50μ1终止液，10分钟内在酶标仪上读取OD450nm值；(10)结果计算：阴性质控血清1:2稀释对照孔OD450nm值＜0.4，阳性质控血清1:2稀释对照孔OD450nm值＞1.0，待检疫苗与对照样品测定的OD450nm值采用RelPot4.0软件进行相对效力RP值计算，当RP值大于1.0则待检疫苗合格。其中，洗涤液是用去离子水稀释后的1倍工作洗涤液。微生物资源信息本专利技术涉及的猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)SH株(保藏号为CGMCCNo.2389，由南京农业大学姜平教授提供)，该毒株为我国商品化猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)的生产用种毒，猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)是由中华人民共和国农业部批准为二类新兽药(农业部公告1448号，2010.08.27发布)。本专利技术通过ELISA抗原检测试剂盒检测疫苗效力，该试剂盒以及基于该试剂盒的检测方法将疫苗中蛋白含量与对照样品进行比较，无需对试验动物进行免疫，一方面，省时省力，降低成本，另一方面，可以使疫苗的效力检验减少对试验动物的依赖，降低了试验动物本身的差异对效力检验的影响，尊重了动物试验的“3R”原则。附图说明图1为实施例纯化后PCV2全病毒蛋白的WesternBlot鉴定，其中，PM为彩色预染蛋白质分子标准量，1为PK细胞培养物，2为PCV2全病毒蛋白。图2为实施例阳性质控血清的SDS-PAGE鉴定，其中，PM为彩色预染蛋白质分子标准量，1为纯化前的兔血清，2为纯化后的兔血清。具体实施方式实施例1：一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。试剂盒各组成的配制和制备说明：1、猪圆环病毒2型灭活培养物的制备：将猪圆环病毒2型毒种按5％(V/V)接种于长成良好单层PK细胞的培养瓶中，置37℃下吸附30分钟，加入含有2％新生牛血清的DMEM维持液，置37℃下旋转培养，转速为10～12转/小时，每日观察1～2次，细胞应生长良好，培养4日后，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定，将检验合格的病毒液加入β-丙酰内酯灭活，使其终浓度为0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；所述包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；所述对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，所述猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA抗原检测试剂盒包括包被板、阳性质控血清、阴性质控血清、对照样品、酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液；所述包被板由猪圆环病毒2型抗原包被，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活培养物纯化后的猪圆环病毒2型全病毒蛋白；所述对照样品为猪圆环病毒2型参考疫苗，所述猪圆环病毒2型参考疫苗为猪圆环病毒2型灭活培养物与佐剂混合制成。2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述猪圆环病毒2型灭活培养物由以下方法制得：将猪圆环病毒2型毒种接种于PK细胞的培养瓶中，置37℃下吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃下旋转培养，转速为10～12转/小时，培养4日后，置-20℃下冻融3次，收获细胞培养物并留样作病毒含量测定，将检验合格的病毒液加入β-丙酰内酯灭活，使其终浓度为0.1％，随即充分混匀，4℃20小时，37℃振摇2小时，得到所述猪圆环病毒2型灭活培养物。3.根据权利要求2所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述猪圆环病毒2型抗原的包被浓度为0.05-5μg/ml，包被稀释液为0.1mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液。4.根据权利要求3所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控血清为所述猪圆环病毒2型全病毒蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔后采集血清，经MABSELECT纯化所得，稀释比例为1:1000-1:4000；所述阴性质控血清为健康新西兰大白兔的血清经MABSELECT纯化后所得，清稀释比例为1:50-1:500。5.根据权利要求4所述的一种猪圆环病毒2型的ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，稀释浓度为1:1000-1:20000，稀释液为含有0.1-5％(W/V)的牛血清蛋白和0.02-0.05％(V/V)ProClin300的磷酸盐缓冲液，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪芬芳，肖澄，董彦鹏，徐凤，胡静雅，车巧林，周琳，耿晓眉，谢洁，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32