SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术提供了SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本发明专利技术人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测SAE2在肾透明细胞癌组织中的相对表达量，能够判断肾透明细胞癌患者出现肾透明细胞癌复发转移的风险。本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肾透明细胞癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肾透明细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Application of SAE2 in the preparation of prognostic assessment kit for renal clear cell carcinoma

【技术实现步骤摘要】
SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用
本专利技术涉及SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用。
技术介绍
肾实质癌是来源于肾小管上皮细胞的腺癌，85％为透明细胞癌，还有一部分为颗粒细胞癌及混合细胞癌。癌中常有出血、坏死、囊变和钙化。生于肾实质内，长大后浸润、压迫、破坏肾盂肾盏，向肾包膜外发展，形成血管瘤栓或转移到淋巴结及其他脏器。肾透明细胞癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，肾透明细胞癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高肾透明细胞癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的肾透明细胞癌肾透明细胞切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与肾透明细胞癌早期复发转移的关系，这对提高肾透明细胞癌术后治疗效果、评估肾透明细胞癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。SUMO化修饰是一个动态可逆的过程，SUMO分子通过在E1活化酶、E2结合酶和E3连接酶的参与下共价结合到底物蛋白赖氨酸残基上，调控底物蛋白的结构与功能，而SENPs则通过特异性地对底物靶蛋白去SUMO化修饰，与SUMO分子共同调节底物蛋白的SUMO化状态，进而调控细胞功能。SAE2是SUMO的E1活化酶之一，对SUMO信号通路具有重要的影响。本专利技术研究发现在肾透明细胞癌中的SAE2表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示SAE2可作为肾透明细胞癌的术后预后的有效预警蛋白。肾透明细胞癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而SAE2做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道SAE2与判断肾透明细胞癌预后或肾透明细胞癌转移相关。
技术实现思路
本专利技术目的是提供SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本专利技术采用的技术方案是：SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用。本专利技术人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测SAE2在肾透明细胞癌组织中的相对表达量，能够判断肾透明细胞癌患者出现肾透明细胞癌复发转移的风险。基于SAE2表达量与肾透明细胞癌复发转移的相关性，以该蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肾透明细胞癌的预后判断，因此可将SAE2作为分子标记，利用SAE2单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测SAE2在肾透明细胞癌组织中的相对表达量。所述试剂盒主要包括：人源SAE2单克隆抗体或多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。专利技术人在发现，SAE2在复发转移肾透明细胞癌组织中表达高于未复发转移肾透明细胞癌组织，可以推测SAE2在肾透明细胞癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国内外文献，SAE2与肾透明细胞癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本实验中，SAE2在肾透明细胞癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常肾透明细胞组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，SAE2在复发转移组中表达也上调，表明SAE2可能作为促进因子参与肾透明细胞癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，SAE2表达程度与肾透明细胞癌患者的预后有关，SAE2高表达的患者预后不良(P<0.05)。综上所述，SAE2在肾透明细胞癌组织中高表达，SAE2的高表达与肾透明细胞癌患者术后复发转移有关。SAE2可以作为肾透明细胞癌预后的一个重要候选分子标记物。优选的，所述人源SAE2多克隆抗体由序列为SEQIDNO.1所示的SAE2免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。具体的，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01MEDTA修复液。本专利技术所述试剂盒的使用方法如下：(a)病理标本来自于肾透明细胞癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：(c)制备肾透明细胞癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。(f)PBS清洗3次，每次5min。(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01MEDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。(K)加入一抗：SAE2抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇:2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。(P)利用显微镜和成像装置随机选取肾透明细胞癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用AperioImageScope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(PositivePixelCountV9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本专利技术显示SAE2与肾透明细胞癌的预后具有显著的相关性，为预测肾透明细胞癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肾透明细胞癌患者的预后有重要作用。当癌组织SAE2免疫组化评分高于0.479时，肾透明细胞癌易出现复发转移，肾透明细胞癌患者术后易死亡。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肾透本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以SAE2作为分子标记，利用人源SAE2单克隆抗体或人源SAE2多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测SAE2在肾透明细胞癌组织中的相对表达量。

【技术特征摘要】
1.SAE2在制备肾透明细胞癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以SAE2作为分子标记，利用人源SAE2单克隆抗体或人源SAE2多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测SAE2在肾透明细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：林尧，王清水，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建,35