一种催化合成2,5-二甲基吡嗪的重组菌制造技术

本发明专利技术公开了一种催化合成2,5‑二甲基吡嗪的重组菌，属于生物合成技术领域。本发明专利技术的可以利用L‑苏氨酸高产2,5‑DMP的菌株，重组表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)。优选地，共表达NOX和E.coli来源的苏氨酸脱氢酶的重组枯草芽孢杆菌，在以5.83g/L的L‑苏氨酸为底物发酵24h时，产量可达616.04mg/L，生产强度可达25.67mg/(L·h)，转化率可达10.6％；该菌株与野生型菌株相比，产量提高了22.5倍，生产强度和转化率以大幅提升，实现了2,5‑DMP高效的生物转化。

【技术实现步骤摘要】
一种催化合成2,5-二甲基吡嗪的重组菌
本专利技术涉及一种催化合成2,5-二甲基吡嗪的重组菌，属于生物合成

技术介绍
烷基吡嗪是一类支链带有烷基基团的含氮杂环化合物，作为重要的风味物质，主要贡献食品中的坚果味，烤肉味和烤面包味。烷基吡嗪由于阈值低，可以显示出强烈的气味特性，是我国GB2760-86规定允许使用的香精物质，在食品工业中主要用作调味的食品添加剂和一些香料中间体。烷基吡嗪除了具有独特的风味价值之外，在医药方面也具有重要价值，可用作药物或医药中间体。TTMP被发现可以作为药物治疗一些疾病，例如中风、心肌细胞损伤、膝骨关节炎等。另外，TTMP还可以作为其他生物药物的前体来源，例如，4-(2,3,5,6-TTMP-1)-4'-去甲表鬼臼是一种具有较强抗肿瘤活性的新型化合物，TTMP-2'O-阿魏酸钠可以提供神经保护，防止神经炎症和脑损伤。2,5-DMP可以作为抗菌类药物5-甲基吡嗪-2-羧酸的重要合成原料。在烷基吡嗪的生产方面，其主要通过化学方法合成，以2,5-DMP的化学合成为例，目前2,5-DMP的化学合成方法主要包括液相法和气相法。由于化学合成普遍存在严峻的环保问题，并且可能存在不希望的副产物，使得分离提纯相对困难，另外，反应条件一般较剧烈，设备要求较高，且产品不是天然的，这些因素都促使风味化合物生产公司将注意力集中在生物来源的风味化合物上。在风味化合物微生物合成研究领域遇到的第一个绊脚石便是普遍缺乏生化知识，虽然可能存在合理的假设，但通常缺少使用标记前体的证据以及所涉及的酶和基因的鉴定。烷基吡嗪作为一种重要的风味化合物，尽管对于烷基吡嗪微生物来源的研究已经探索了很长时间，但是对于其合成机制的认知还是非常有限的。目前，只有TTMP的微生物合成机制被阐明：首先，B.subtilis以D-葡萄糖为底物，经糖酵解途径生成丙酮酸，后者在α-乙酰乳酸合酶及α-乙酰乳酸脱羧酶催化作用下生成乙偶姻；同时，原材料蛋白在蛋白质水解酶作用下生成氨基酸，后者继而生成氨，或者在铵盐存在的情况下，乙偶姻与氨/铵可以通过非酶促反应生成2-氨基-3-丁酮，继而2-氨基-3-丁酮经过脱水缩合与氧化反应生成TTMP。然而，TTMP和2,5-DMP的微生物合成途径完全不同，无法按照已有的TTMP合成途径解析确定2,5-DMP合成过程。综上，目前市场上2,5-DMP的生产方法主要通过化学方法合成，但化学法合成存在缺陷。虽然也有微生物菌株能够合成潜在有价值的风味化合物，但是其产量往往很低；而且由于缺乏关于生化途径，酶和代谢调节的知识，使得利用生物技术生产风味化合物的发展受到阻碍。
技术实现思路
为了解决上述至少一个问题，本专利技术提供了一种催化合成2,5-二甲基吡嗪的重组菌。该菌可以利用L-苏氨酸高产2,5-DMP的菌株，以5.83g/L的L-苏氨酸为底物发酵24h的产量可达616.04mg/L，生产强度可达25.67mg/(L·h)，转化率可达10.6％；与野生型菌株相比，该菌株的产量提高了22.5倍，实现了2,5-DMP高效的生物转化。本专利技术的第一个目的是提供一种催化合成2,5-二甲基吡嗪的重组菌，所述重组菌重组表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)。在一种实施方式中，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的。在一种实施方式中，所述重组菌是以B.subtilis168为宿主构建得到的在一种实施方式中，所述苏氨酸脱氢酶为B.subtilis、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens、P.putida、E.coli、A.candidus或者A.uvarum来源的苏氨酸脱氢酶。在一种实施方式中，所述苏氨酸脱氢酶tdh的序列与GeneBankID分别为NP_389581(B.subtilis168)、WP_085959523(B.licheniformisATCC14580)、WP_014470388(B.amyloliquefaciensDSM7)、WP_064301272(P.putida)、NP_418073(E.coliK-12)、XP_024673913(A.candidus)、XP_025487049(A.uvarum)的序列相同。在一种实施方式中，所述重组菌是利用pMA0911载体表达苏氨酸脱氢酶。在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pMA0911上得到重组表达质粒pMA0911-tdh，然后将表达质粒pMA0911-tdh转入B.subtilis168中进行表达。在一种实施方式中，所述表达还包括：将苏氨酸脱氢酶与NOX进行共表达。可选地，所述共表达，是将NOX编码基因nox与TDH编码基因tdh在同一质粒转录表达。在一种实施方式中，所述共表达，包括：获取nox基因，然后将nox基因连接到酶切后的pMA0911-tdh中，连接，得到共表达的重组质粒pMA0911-tdh-nox；重组质粒转化宿主细胞，即得到苏氨酸脱氢酶与NOX进行共表达的重组菌。本专利技术的第二个目的是提供一种生物合成2,5-DMP的方法，所述方法是利用本专利技术的重组菌作为生产菌株。在一种实施方式中，所述发酵是利用含有L-苏氨酸的培养基进行发酵生产。在一种实施方式中，所述发酵是以L-苏氨酸为唯一底物进行发酵生产。在一种实施方式中，所述发酵使用的培养基为含有L-苏氨酸的LBT液体培养基。可选地，所述LBT液体培养基中，含有蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、一定量L-苏氨酸。本专利技术的优点和效果：本专利技术构建了可以利用L-苏氨酸高产2,5-DMP的菌株，该菌株重组表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)。优选地，共表达NOX和E.coli来源的苏氨酸脱氢酶的重组枯草芽孢杆菌，在以5.83g/L的L-苏氨酸为底物发酵24h时，产量可达616.04mg/L，生产强度可达25.67mg/(L·h)，转化率可达10.6％；该菌株与野生型菌株相比，产量提高了22.5倍，生产强度和转化率以大幅提升，实现了2,5-DMP高效的生物转化。附图说明图1TDH表达载体pMA0911-tdh的构建与酶切验证；其中，A：质粒pMA0911的酶切与不同菌株的TDH编码基因tdh的PCR扩增，M：marker，1：pMA0911，2：tdh(B.subtilis168)，3：tdh(B.licheniformisATCC14580)，4：tdh(B.amyloliquefaciensDSM7)；B：重组质粒pMA0911-tdh或pMA0911-nox示意图；C：重组质粒pMA0911-tdh的酶切验证，M：marker，1：pMA0911，2：pMA0911-tdh(B.s)，3：pMA0911-tdh(B.l)，4：pMA0911-tdh(B.a)，5：pMA0911-tdh(P.p)，6：pMA0911-tdh(E.c),7：pMA0911-tdh(A.c)，8：pMA0911-tdh(A.u)。图2基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh菌液PCR验证；其中，M：marker，1：B.subtilis168/pMA0911，2：B.subtilis168/pMA0911-tdh(B.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种催化合成2,5‑二甲基吡嗪的重组菌，其特征在于，所述重组菌重组表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)。

【技术特征摘要】
1.一种催化合成2,5-二甲基吡嗪的重组菌，其特征在于，所述重组菌重组表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌为宿主构建得到的。3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述苏氨酸脱氢酶为B.subtilis、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens、P.putida、E.coli、A.candidus或者A.uvarum来源的苏氨酸脱氢酶。4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是利用pMA0911载体表达苏氨酸脱氢酶。5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述表达还包括：将苏氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，张丽杰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32