一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗及其应用，本发明专利技术制备的无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种，系重组表达经过密码子优化的气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素A重组融合蛋白的大肠杆菌，用该菌种生产的气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗可以最大限度地保证疫苗的安全性，又保持其有效性。同时，该菌种表达的疫苗抗原能够以可溶的形式表达，一方面避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本；一方面能够提高融合蛋白的抗原性，因此具有制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好等优点，是我国现行气肿疽梭菌疫苗升级换代的理想候选疫苗。

A strain of Clostridium gangrenosum subunit vaccine with non-toxic emphysema and its application

【技术实现步骤摘要】
一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用
本专利技术涉及一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用。属兽用生物制品领域。
技术介绍
气肿疽梭菌病又俗称为黑腿病，主要感染反刍动物，特别是放牧的新生反刍动物对气肿疽梭菌最敏感。该病病程短，发病急，往往来不及救治就突然死亡。为此，疫苗接种是防控该病的主要手段，而商品化的气种疽疫苗主要是强毒力菌株C54-1和C54-2两株的灭活疫苗。该疫苗在预防动物气肿疽方面虽然取得了一定的效果，但疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及强毒力气肿疽梭菌的灭活，存在菌株外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的气肿疽梭菌病基因工程疫苗，是未来的发展方向。气肿疽梭菌的主要毒力因子有鞭毛、细胞毒素A(CctA)以及唾液酸酶以及其他毒力因子，包括代表耐氧的溶血素、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶及不耐氧的溶血素(VileiEM,JohanssonA,SchlatterY,RedheadK,FreyJ.GeneticandfunctionalcharacterizationoftheNanAsialidasefromClostridiumchauvoei.VetRes2011；42(1):2.)。其中，鞭毛与气肿疽的毒力密切相关，且鞭毛蛋白具有良好的免疫原性，能够对气肿疽提供免疫保护反应(ChandlerHM,GulasekharamJ.TheprotectiveantigenofahighlyimmunogenicstrainofClostridiumchauvoeiincludinganevaluationofitsflagellaasaprotectiveantigen.JGenMicrobiol1974；84(1):128-34；TamuraY,Kijima-TanakaM,AokiA,OgikuboY,TakahashiT.ReversibleexpressionofmotilityandflagellainClostridiumchauvoeiandtheirrelationshiptovirulence.Microbiology1995；141(Pt3):605-610.)。已有的研究发现，外源表达的鞭毛蛋白FliA(C)能够诱导小鼠产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(气肿疽nanA与fliA融合基因亚单位疫苗的制备及免疫效果评价[D].延边大学,2014.)。2012年，Joachim等人发现了气肿疽梭菌的一种新型毒素，命名为气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)。该毒素是细菌毒素的杀白细胞素总科、β-微孔形成毒素家族中的一种，在气肿疽梭菌中很保守。进一步的研究发现，天然的CctA以及通过大肠杆菌表达的融合蛋白rCctA::NusA和酶切后去掉标签的rCctA均具有很强的细胞毒性和溶血活性。针对rCctA的兔多克隆抗体能够完全中和rCctA和气肿疽培养物的细胞毒性和溶血活性，这说明CctA是气肿疽梭菌的主要细胞毒素和溶血因子。此外，Joachim等人还发现利用外源性融合蛋白rCctA::LTB免疫的动物能够获得对气肿疽梭菌的免疫保护(FreyJ,JohanssonA,SibylleBürki,etal.CytotoxinCctA,amajorvirulencefactorofClostridiumchauvoeiconferringprotectiveimmunityagainstmyonecrosis[J].Vaccine,2012,30(37),5500-5505)。最新的研究发现，CctA的中间区域(第56位～222位氨基酸，以下成为CctAN)能够在真核细胞表达，并可作为核酸疫苗进行免疫，诱导实验动物产生较好的体液免疫应答和细胞免疫应答(齐强.牛气肿疽CctA基因核酸疫苗的制备及免疫效果评价[D].2017.)。
技术实现思路
本专利技术目的在于利用构建的表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA(C)和细胞毒素A(CctA)的无毒片段(第56位～第222位氨基酸)的重组融合蛋白的大肠杆菌制备出无毒性的重组融合蛋白(rFliACctAN)，用于预防由气肿疽梭菌感染引起的疾病。本专利技术技术方案1.一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其生产方法及其应用，其特征在于所述菌种为重组表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白(FliA(C))和细胞毒素A(CctA)的重组融合蛋白(rFliACctAN)的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)细胞，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/MA株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17319。所述菌种可用来生产气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素A重组融合蛋白，从而制备气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗，该疫苗用于预防由气肿疽梭菌感染引起的疾病。2.本专利技术所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的rFliACctAN，含有鞭毛蛋白FliA(C)和细胞毒素A(CctA)；与野生型细胞毒素A(CctA)相比，只含有无毒片段(第56位～第222位氨基酸)；所述重组融合蛋白rFliACctAN无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。3.本专利技术所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的融合蛋白rFliACctAN，其编码的基因序列经过密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高表达和可溶表达。4.本专利技术所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的融合蛋白rFliACctAN，其C端含有便于蛋白纯化的标签6组氨酸(6*His)标签。5.本专利技术所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种，其特征在于所述气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗的制备方法为：用所述表达rFliACctAN的埃希氏大肠菌BL/MA株作为疫苗生产菌株，经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后，加佐剂混合制成。6.本专利技术权利要求1所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于用于表达融合蛋白rFliACctAN的“宿主细胞”，涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞；所述宿主细胞优选地是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。本专利技术有益效果本专利技术将气肿疽梭菌鞭毛蛋白FliA(C)以及CctA的无毒片段(第56位～第222位氨基酸)进行融合表达，获得了对于动物体无毒的重组融合蛋白(rFliACctAN)。本专利技术进一步公开了含有所述rFliACctAN编码基因的表达载体和宿主细胞。本专利技术的rFliACctAN在小鼠体内完全无毒，且在豚鼠模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本专利技术的rFliACctAN或其编码基因能够应用于制备预防气肿疽梭本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种为重组表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白(FliA(C))和细胞毒素A(CctA)的重组融合蛋白(rFliACctAN)的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)细胞，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/MA株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17319。所述菌种可用来生产气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素A重组融合蛋白，从而制备气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗，该疫苗用于预防由气肿疽梭菌感染引起的疾病。

【技术特征摘要】
1.一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种为重组表达气肿疽梭菌鞭毛蛋白(FliA(C))和细胞毒素A(CctA)的重组融合蛋白(rFliACctAN)的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)细胞，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/MA株，并已于2019年03月08日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo.17319。所述菌种可用来生产气肿疽梭菌鞭毛蛋白和细胞毒素A重组融合蛋白，从而制备气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗，该疫苗用于预防由气肿疽梭菌感染引起的疾病。2.如权利要求1所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用，其特征在于所述菌种表达的重组融合蛋白rFliACctAN，含有鞭毛蛋白FliA(C)和细胞毒素A(CctA)；与野生型细胞毒素A(CctA)相比，只含有无毒片段(第56位～第222位氨基酸)；所述重组融合蛋白rFliACctAN无毒力，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。3.如权利要求1所述一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，陈小云，刘莹，彭小兵，薛麒，朱真，李启红，印春生，姚文生，康凯，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11