一种不依赖VB12的聚球藻PCC 7002工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种不依赖VB12的聚球藻PCC 7002工程菌及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，是通过同源重组实现外源基因的插入，将聚球藻PCC 7002中的A2746上游的同源臂基因片段、聚球藻PCC 7002的cpcBA启动子基因、目的蛋白表达基因、钴胺素非依赖型甲硫氨酸合成酶基因metE、聚球藻PCC 7002中的A2746下游的同源臂基因片段依次连接到pAQ1质粒上，得到载体Q29；将Q29载体转化到聚球藻PCC 7002，获得不依赖VB12的聚球藻PCC 7002工程菌。本发明专利技术利用基因工程在PCC 7002菌株中导入了metE基因的重组质粒，获得在不添加VB12的条件下生长，且菌株表达蛋白使得细菌自动沉降的不依赖VB12的聚球藻PCC 7002工程菌，可用于借助聚球藻表达的各种外源蛋白的表达。

An Engineering Bacterium PCC 7002 of Chlorococcus spp. Independent of VB12 and Its Construction Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
聚球藻PCC7002是一种单细胞蓝细菌，它可以在海水表面生长，可以耐受强的阳光照射，而且可以耐受较高的盐度和温度，如40℃。该细菌属于光合自养型，具有较快的生长速率。此外，由于细菌的基因序列容易获取、易吸收外援基因以及分子克隆技术的发展，这使得它成为一个十分重要的研究平台，可以应用于一些附属品的表达，具有较高的经济价值。同其它的藻类相比，聚球藻PCC7002的缺点是它的生长需要添加外援的VB12，它不具备合成钴胺素VB12的能力。在培养过程中，钴胺素是甲硫氨酸生物合成中甲硫氨酸合成酶的辅因子，其作用机制是甲硫氨酸合成酶催化甲基的转移，使得N5-甲基-5，6，7，8-四氢叶酸转化成1-同型半胱氨酸进而生成甲硫氨酸。这种酶具有两种异构体，分别是钴胺素依赖型甲硫氨酸合成酶，metH；另一种是钴胺素非依赖型甲硫氨酸合成酶，metE。而聚球藻PCC7002本身具有metH，因此它是一种VB12的营养缺陷型菌株，此外，研究发现metE基因存在于在所有的植物、真细菌、真菌、一些藻类和一些蓝细菌中。大肠杆菌自身携带有两种形式的甲硫氨酸合成酶，可以依据环境中钴胺素的存在情况进行转换。而蓝细菌中核糖开关可以精确的控制甲硫氨酸合成酶的表达，其调控的机理是蛋白质合成时钴胺素的结合使得信使RNA的转录物的构象发生改变。外源基因的表达已经被证明可以赋予物种间新的特性或者互补缺陷。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术提出了一种不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌及其构建方法和应用，是利用基因工程在聚球藻PCC7002菌株中导入了metE基因的重组质粒，获得在不添加VB12的条件下生长，且菌株表达蛋白使得细菌自动沉降的不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌。本专利技术提出的一种不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌，是通过同源重组实现外源基因的插入；所述外源基因的表达受控于SEQIDNO：1所示的聚球藻PCC7002的PcpcBA启动子；所述外源基因为目的蛋白表达基因(GeneofInterest，GOI)和SEQIDNO：2所示的钴胺素非依赖型甲硫氨酸合成酶基因metE基因；所述同源重组基因为SEQIDNO：3所示的聚球藻PCC7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQIDNO：4所示的聚球藻PCC7002中A2746下游同源臂基因片段；将A2746上游的同源臂基因片段、cpcBA启动子基因、目的蛋白表达基因、metE基因、A2746下游的同源臂基因片段依次连接到pAQ1质粒上，得到载体Q29；所述载体Q29序列中含有2段与聚球藻PCC7002中A2746位点同源的DNA区域，分别是与SEQIDNO：3所示的聚球藻PCC7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQIDNO：4所示的聚球藻PCC7002中A2746下游同源臂基因片段的序列相同；将Q29载体转化到聚球藻PCC7002，即得到不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌。本专利技术还提出了上述不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)利用引物对源于E.coli的metE基因进行PCR扩增，得到SEQIDNO：2所示的metE基因；(2)通过PCR扩增或直接合成得到目的蛋白表达基因；(3)利用引物对聚球藻PCC7002基因A2746的上下游基因片段进行PCR扩增，得到SEQIDNO：3所示的A2746上游同源臂基因片段和SEQIDNO：4所示的A2746下游同源臂基因片段；(4)将SEQIDNO：3所示的A2746上游的同源臂基因片段、SEQIDNO：1所示的cpcBA启动子基因、目的蛋白表达基因、SEQIDNO：2所示的metE基因、SEQIDNO：4所示的A2746下游的同源臂基因片段依次连接到pAQ1质粒上，得到载体Q29；所述载体Q29序列中含有2段与聚球藻PCC7002中A2746位点同源的DNA区域，分别是与SEQIDNO：3所示的聚球藻PCC7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQIDNO：4所示的聚球藻PCC7002中A2746下游同源臂基因片段的序列相同；(5)将Q29载体转化到聚球藻PCC7002，即得到不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌。本专利技术还提出了上述不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌在外源蛋白表达中的应用。有益效果：本专利技术提出了一种不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌及其构建方法，是将来源于大肠杆菌的metE基因扩增后插入到聚球藻PCC7002的染色体上表达，使得该细菌恢复钴胺素缺陷型，不添加VB12即可生长；此外，metE基因可以作为选择标记来应用于外源基因在聚球藻PCC7002中的选择和表达，外源基因的表达可以使得构建的工程菌具备了快速沉降的特点，从而减少菌体收集这一步骤，降低成本。该工程菌可以应用于借助聚球藻PCC7002表达的各种外源蛋白的表达，不仅克服VB12的缺陷实现室外水域的培养，而且蓝细菌的自动沉降对蛋白的提取也更为方便，是一种理想的外源蛋白表达平台，应用广泛。附图说明图1为本专利技术重组质粒Q29的构建流程示意图；图2为本专利技术所构建工程菌株的外源基因整合到聚球藻PCC7002染色体上的示意图；图3为本专利技术metE基因插入后在A2746位点的染色体扩增示意图；其中，M为DNAMarker，泳道1为大肠杆菌的metE基因，泳道2为A2746上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段间的基因片段，泳道3为A2746上游同源臂基因片段到metE基因间的基因片段，泳道4为metE基因到A2746下游同源臂基因片段间的基因片段，泳道5为聚球藻PCC7002野生型菌株A2746基因片段；图4为本专利技术构建的聚球藻PCC7002菌株在不添加VB12的A+培养基中和野生型PCC7002菌株在A+培养基对比生长曲线图；图5是GOI表达的全细胞提取物的Westernblot标记检测；其中，25kD的GOI如图中箭头所示，M为纯化的GOI，泳道1为GOI在染色体上的表达，泳道2为GOI在质粒上的表达。图6为重组菌株GOI表达后的快速沉降展示图；其中左边3只试管中是野生型，右边三只试管中是重组菌株；图6-a、6-b、6-c分别是静置0min、5min和60min后的示意图；具体实施方式下面，通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。本专利技术中所用试剂的购处：HifiDNA聚合酶NEWEnglandBiolabsPCR产物纯化试剂盒Qiagen限制性内切酶NEBlabDNA连接酶Thermo蛋白预制胶BioRadHis探针试剂盒Thermo所用的试剂若无特殊说明，本专利技术中涉及的药品及试剂均为普通市售产品。所用的培养基配方和培养条件如下：(1)大肠杆菌K12采用的液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L；采用的固体培养基是在液体培养基中再添加15g/L的琼脂。(2)野生型聚球藻PCC7002采用的液体A+培养基各组分添加量如下：氯化钠18g/L，氯化钾0.6g/L，硝酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不依赖VB12的聚球藻PCC 7002工程菌，其特征在于，是通过同源重组实现外源基因的插入；所述外源基因的表达受控于SEQ ID NO：1所示的聚球藻PCC Synechococcus sp.7002的PcpcBA启动子；所述外源基因为目的蛋白表达基因和SEQ ID NO：2所示的钴胺素非依赖型甲硫氨酸合成酶基因metE基因；所述同源重组基因为SEQ ID NO：3所示的聚球藻PCC 7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQ ID NO：4所示的聚球藻PCC 7002中A2746下游同源臂基因片段；将A2746上游的同源臂基因片段、cpcBA启动子基因、目的蛋白表达基因、metE基因、A2746下游的同源臂基因片段依次连接到pAQ1质粒上，得到载体Q29；所述载体Q29序列中含有2段与聚球藻PCC 7002中A2746位点同源的DNA区域，分别是与SEQ ID NO：3所示的聚球藻PCC 7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQ ID NO：4所示的聚球藻PCC 7002中A2746下游同源臂基因片段的序列相同；将Q29载体转化到聚球藻PCC 7002，即得到不依赖VB12的聚球藻PCC 7002工程菌。...

【技术特征摘要】
1.一种不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌，其特征在于，是通过同源重组实现外源基因的插入；所述外源基因的表达受控于SEQIDNO：1所示的聚球藻PCCSynechococcussp.7002的PcpcBA启动子；所述外源基因为目的蛋白表达基因和SEQIDNO：2所示的钴胺素非依赖型甲硫氨酸合成酶基因metE基因；所述同源重组基因为SEQIDNO：3所示的聚球藻PCC7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQIDNO：4所示的聚球藻PCC7002中A2746下游同源臂基因片段；将A2746上游的同源臂基因片段、cpcBA启动子基因、目的蛋白表达基因、metE基因、A2746下游的同源臂基因片段依次连接到pAQ1质粒上，得到载体Q29；所述载体Q29序列中含有2段与聚球藻PCC7002中A2746位点同源的DNA区域，分别是与SEQIDNO：3所示的聚球藻PCC7002中A2746上游同源臂基因片段和SEQIDNO：4所示的聚球藻PCC7002中A2746下游同源臂基因片段的序列相同；将Q29载体转化到聚球藻PCC7002，即得到不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌。2.一种根据权利要求1所述的不依赖VB12的聚球藻PCC7002工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，
申请(专利权)人：深圳市奥极因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44