本发明专利技术属于兽用微生物添加剂制备技术领域，具体涉及一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为出发菌株，通过同源重组敲除淀粉酶基因amy‑E并引入猪来源的表皮生长因子EGF，构建稳定且高分泌型工程菌，实现了猪表皮生长因子的高效分泌表达。动物实验表明该菌株对受损肠道具有较好的修复作用，同时能够降低IFN‑γ、IL‑1β、TNF‑α等炎症因子的分泌，促进肠绒毛生长，提高动物生长性能。为实现猪来源的表皮生长因子的工业化制备生产奠定了基础，为饲添抗生素的替代及畜牧业的健康、可持续发展提供技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用
本专利技术属于动物基因工程
，具体涉及一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌工程菌及其制备方法与应用。
技术介绍
表皮生长因子是1962年Cohen用梭甲基纤维素柱从小鼠颇下腺分离纯化神经生长因子(NGF)时发现的一种活性物质，当时根据它促进新生小鼠门齿的萌出及眼睑睁开的功能，将它命名为“齿睑因子(Tooth-LidFactor)”，随后发现这种多肽能够促进表皮生长，于是改称为“表皮生长因子(mEGF)”。表皮生长因子主要由唾液腺、胆汁、Paneth细胞、十二指肠的Brunner’s腺和胰腺等分泌至胃肠道，发育中的幼龄动物EGF主要来源于母乳和唾液。EGF对酸和热比较稳定，能抵抗胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶的消化作用，这对其维持结构的稳定和发挥生物学作用具有重要的意义。猪表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，简称pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽，分子量为6216道尔顿，其功能和结构与人、小鼠、大鼠等动物的EGF类似。EGF是一种强有力的细胞分裂促进因子，它不仅在上皮细胞，而且在间皮和内皮细胞发挥其生物效应。EGF在机体发育中起作用，影响其生长和分化。EGF对生物体的作用表现得极为广泛，主要体现在:(1)在体内刺激皮肤组织、角膜、肺、气管上皮组织的生长繁殖；(2)诱导新生眼睑的打开；(3)加速胃溃疡的治疗和抑制胃酸的分泌；(4)增强表皮细胞的蛋白质、RNA的合成和细胞代谢；(5)加速角膜、肠道等创伤的修复；(6)对某些癌症的治疗有一定的疗效等。因此，猪表皮生长因子被广泛作为药物和饲料营养添加剂来提高动物肠道健康，促进营养物质消化吸收。此外表皮生长因子在化妆品和制药领域也具有诸多应用。猪的血液、乳汁及胃液等含有的内源性pEGF很少，并且处于与受体结合的生理状态，从生物来源中提取pEGF比较困难且成本较高，难以实现。目前生产hEGF主要有2种途径：一种是化学合成法，虽然产物纯度高但是产率不高，而且蛋白质不能像生物合成一样折叠，无法工业化生产。另一种方法是采用基因工程技术构建重组质粒表达pEGF。基因重组pEGF的基本策略首先构建出含pEGF目的基因的整合表达载体，再将该表达载体转化至枯草芽孢杆菌，使pEGF整合到枯草芽孢杆菌基因组中，最后对该重组枯草芽孢杆菌进行发酵，获得具有生物学活性的重组pEGF。在现代集约化养殖生产体系下，为了获得最大的经济效益，仔猪的中、早期断奶被广泛采用。然而仔猪早期断奶不可避免地引起了断奶应激的发生，随断奶日龄的提前，断奶应激更加强烈，应激损伤更为严重。断奶应激引起仔猪肠道微生态环境失衡、功能紊乱、肠道发育受阻，而影响营养物质的消化、吸收，导致其生产性能下降，对病原微生物易感。生产上为了降低早期断奶应激对仔猪生产性能的影响，减少养殖业经济损失，通常采用在饲料中长期添加抗生素，由于抗生素的滥用，致使微生物产生耐药性，造成动物内源性感染和二重感染，易在畜产品和环境中造成残留等问题引起了人们的广泛关注。目前国内外推行健康养殖，生产绿色食品，允许作饲料添加剂的抗生素已寥寥无几。因此，开发或寻找替代抗生素的产品已经成为当今医药业和畜牧业开发的热点。益生菌作为饲添抗生素最佳替代品之一已备受关注。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedsafe”(GRAS)安全级别。作为食品安全级别的原核表达宿主，枯草芽孢杆菌具备大肠杆菌(E.coli)没有的一些优良特性，如非致病性，绝大多数对人畜无害，不产生内毒素和致热敏蛋白质；其分泌信号肽及分子伴侣系统非常高效，从而具有很强的分泌蛋白能力，有助于重组蛋白质保持其天然构象和生物活性。枯草芽孢杆菌有悠久广泛的应用历史，生长迅速、培养条件简单、遗传背景较清晰，在相对简单的培养基中能生长到很高的密度，具备良好的发酵生产基础。近年来，枯草杆菌表达系统不断发展和完善,许多外源蛋白获得了高效表达，但同时也存在一些问题。蛋白酶的分泌是枯草杆菌作为表达宿主的限制因素之一，这些蛋白酶没有底物专一性；当外源蛋白分泌表达后，容易被这些蛋白酶降解，从而大大降低产量。而枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB800缺失了8种胞外蛋白酶，减少外源蛋白被降解的风险以提高蛋白表达量。因此，运用基因工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级猪表皮生长因子的有效途径，打破了猪表皮生长因子提取纯化困难的瓶颈，为实现猪表皮生长因子的工业化生产奠定了坚实的基础。本专利技术通过基因工程技术构建高效表达pEGF的枯草芽孢杆菌工程菌，改善动物肠道健康，以达到抗病、促生长的综合效果。为饲料添加剂抗生素的替代和畜牧业的健康、可持续发展提供了技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌及其制备方法与应用。本专利技术包括一种高效、稳定的表达猪表皮生长因子枯草芽孢杆菌工程菌的构建、筛选,以及初步应用，用于缓解仔猪断奶应激，改善断奶仔猪肠道健康，提高生产性能，减少养殖业由于仔猪应激造成的经济损失。本专利技术技术方案如下所述：申请人通过基因工程方法筛选得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌RBs-EGF，BacillussubtilisRBs-EGF，于2019年3月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2019175。在本专利技术的实施方式中，本专利技术的猪表皮生长因子(基因登陆号为NCBI-GeneID:X59516.1)的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示(序列长度为1-159bp)。在本专利技术的实施方式中，申请人以载体PDG1730为出发载体(基因登陆号为NCBI-GeneID:U46199.1)，以来源于枯草芽孢杆菌的组成型启动子p43基因(基因登陆号为NCBI-GeneID:EF473728.1)，该启动子基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示(序列长度为1-337bp)。信号肽SacB基因(基因登陆号为NCBI-GeneID:MH614588.1，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示(序列长度为1-84bp)，构建并重组表达载体转化野生型枯草芽孢杆菌WB800，利用酵母浸出物为碳源的无机盐培养基为发酵培养基发酵生产猪表皮生长因子，得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的枯草芽孢杆菌RBs-EGF，该菌株的保藏编号为CCTCCNO：M2019175。申请人提供了一种表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF的制备方法，所述的方法为：将枯草芽孢杆菌组成型启动子P43，信号肽SacB基因及猪表皮生长因子连接，以载体PDG1730为出发载体，构建得到重组表达载体PDG-P43-SacB-pEGF，用所得的重组表达载体转化枯草芽孢杆菌WB800，得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019175，利用酵母浸出物为碳源的无机盐培养基为发酵培养基大量增殖枯草本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs‑EGF，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019175。
【技术特征摘要】
1.一株表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2019175。2.一株表达猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF的制备方法，其特征在于：将枯草芽孢杆菌组成型启动子P43，信号肽SacB基因及猪表皮生长因子连接，以载体PDG1730为出发载体，构建得到重组表达载体PDG-P43-SacB-pEGF，用所得的重组表达载体转化枯草芽孢杆菌WB800，得到一种产猪表皮生长因子(pEGF)的重组枯草芽孢杆菌RBs-EGF，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2019175，利用酵母浸出物为...
【专利技术属性】
技术研发人员：王喜亮，李越，李毕平，金卉，肖运才，周祖涛，石德时，金秀娥，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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