一种生产人胱抑素C的基因工程菌及方法技术

本发明专利技术公开了一种生产人胱抑素C的基因工程菌及方法。所述基因工程菌为在大肠杆菌(Esherichia coli)中表达人胱抑素C基因的基因工程菌，所述的人胱抑素C基因的3’端带有表达多肽LVPRGS‑n×His的基因，所述的n为4～8之间的整数。利用本发明专利技术的基因工程菌制备胱抑素C蛋白时，纯化过程中不会产生胱抑素C蛋白二聚、多聚体，提高了无标签胱抑素C的产量，1L工程菌液中可获得50mg以上的蛋白；且获得的蛋白纯度高、活性良好，利用其通过免疫Balb/C小鼠以及杂交瘤等技术制备得到的单抗能够识别人血清中胱抑素C且效价高。

A Genetically Engineered Bacteria and Method for Producing Human Cystatin C

【技术实现步骤摘要】
一种生产人胱抑素C的基因工程菌及方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产人胱抑素C的基因工程菌及方法。
技术介绍
胱抑素C(CystatinC)由120个氨基酸组成，含有四个保守的半胱氨酸残基可以形成两个二硫键。它属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，广泛分布人体中并能够在大多数体液中被发现。胱抑素C的血液浓度与肾小球滤过率相关(GFR)，是肾脏健康的重要标志。胱抑素C能被肾小球自由过滤并且在管状细胞中并无分泌，并且它几乎能被管状上皮细胞完全吸收，然后被分解代谢。因此，胱抑素C在血液中的浓度几乎完全依赖于肾小球滤过率，且基本上不受饮食或营养状况的影响。此外，血液浓度胱抑素C也独立于肌肉质量、年龄或性别，与昼夜节律也无关。虽然血清肌酐水平已被用于诊断肾功能几十年，但是现在普遍接受的观点认为，血清肌酐水平的测量在指示肾功能早期急性变化所需的特异性上缺乏灵敏度。而且在诊断肾功能不全时，测量胱抑素C水平明显优于血清肌酐水平。最近有证据表明在血清肌酐水平升高的1或2天前，血清中的胱抑素C水平就已显著升高。许多研究也表明胱抑素C在检测肾小球滤过率减少的微小变化上与肌酐相比的优越性。因此，胱抑素C的血液浓度或其尿液排泄量可以作为肾功能不全的内源性标志物，并用于诊断急性肾小管损伤的严重程度。重组胱抑素C蛋白，可以用作抗原以开发抗胱抑素C抗体，还可以作为诊断试剂盒中的对照。市面上现存的胱抑素C检测试剂盒大多为使用免疫比浊法，进口的试剂盒价格昂贵，而国产的则大多存在胱抑素C蛋白不纯，且试剂盒中所使用的多克隆抗体质量不稳定、批次间差异大等缺点。虽然现今已有研究对于胱抑素C的可溶表达量进行了优化、提升，但其未能解决其在纯化过程中产生的二聚、多聚等问题，从而导致胱抑素C的纯化回收率及产品纯度不佳，导致免疫动物效果不佳或太多假阳性克隆细胞，进而难以利用其制备得到单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中人胱抑素C的纯化回收率低、纯度不佳，进而免疫动物效果不佳等缺陷，提供一种生产人胱抑素C的基因工程及方法。利用本专利技术的基因工程菌制备胱抑素C蛋白时，纯化过程中不会产生胱抑素C蛋白二聚、多聚体，提高了无标签胱抑素C的产量；且获得的蛋白纯度高，几乎无杂蛋白存在；进一步获得的不带任何标签的胱抑素C蛋白生物活性良好，利用其制备得到的单抗能够识别人血清中胱抑素C且效价高。本专利技术人首次发现在胱抑素C蛋白C端连接多肽LVPRGS-n×His可以解决胱抑素C在纯化过程中易聚集的问题，且意外发现将组氨酸标签连接在胱抑素C蛋白的C端，能够保证其N端的活性中心不受影响。本专利技术提供一种生产人胱抑素C的基因工程菌，其是在大肠杆菌(Esherichiacoli)中表达人胱抑素C的基因的基因工程菌，所述的人胱抑素C基因的3’端带有表达多肽LVPRGS-n×His的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。所述的人胱抑素C的氨基酸序列较佳地如序列表中SEQIDNO.1所示。所述的人胱抑素C基因的核苷酸序列较佳地如序列表中SEQIDNO.2所示。所述的n较佳地为6。其中，根据本领域常识，所述的人胱抑素C的基因和所述的表达多肽LVPRGS-n×His的基因可通过同源重组等方法整合到宿主大肠杆菌中进行表达，亦可通过表达载体将两者导入大肠杆菌中进行表达。本专利技术中，优选使用携带含有所述人胱抑素C基因的表达载体和所述表达多肽LVPRGS-n×His的基因的表达载体。较佳地，所述表达载体的骨架为质粒pET-22b(+)。本专利技术中所述的大肠杆菌较佳地为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。本专利技术还提供一种包含人胱抑素C基因的表达载体，所述人胱抑素C基因的3’端带有表达多肽LVPRGS-n×His的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。所述的n较佳地为6。所述的人胱抑素C基因的核苷酸序列较佳地如序列表中SEQIDNO.2所示。如上所述，所述表达载体的骨架较佳地为质粒pET-22b(+)。所述的大肠杆菌较佳地为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。本专利技术还提供一种生产人胱抑素C的方法，所述的方法包括以下步骤：(1)将如上所述的基因工程菌发酵；(2)收集菌体、破碎离心得含有人胱抑素C的上清，纯化即得。为增加人胱抑素C在发酵过程中的表达，较佳地，在步骤(1)中的所述发酵的过程中对所述的基因工程菌进行诱导表达。步骤(2)中所述纯化可为本领域常规的纯化，为提高纯化效率和产量，所述的纯化较佳地为镍磁珠亲和纯化。所述镍磁珠亲和纯化的方法可为本领域常规。较佳地包括下述步骤：(1)溶液配制；所述的溶液可为平衡缓冲液(50mMTris-HCl,150mMNaCl,pH8.0)，洗涤缓冲液(50mMTris-HCl,150mMNaCl,50mMImidazole,pH8.0)以及洗脱缓冲液2(50mMTris-HCl,150mMNaCl,300mMImidazole,pH8.0)；(2)磁珠预处理：镍磁珠悬浮液在离心管中充分混匀，磁性分离去除上清液，随后依次各用1倍磁珠体积的去离子水及平衡缓冲液洗涤磁珠，充分混匀磁珠，再用磁性分离去除上清液；(3)上样：将超声破碎离心所得的上清加入装有已平衡的磁珠的离心管中，放置于旋转混合仪上，室温旋转孵育30min；(4)洗涤：30min后，磁性分离并保留上清液以备后续检测，随后向离心管中加入1倍磁珠体积的洗涤缓冲液，反复颠倒离心管使磁珠重悬，磁性分离，倒出上清以备后续检测，重复2～3次；(5)洗脱：取0.5mL磁珠移入一个新的离心管中，加入1mL的洗脱缓冲液2，充分混匀磁珠，在涡旋仪上涡旋10min，随后磁性分离，取出洗脱液。较佳地，所述的方法还包括步骤(3)：使用凝血酶酶切步骤(2)所得的带有His标签的人胱抑素C，后除去溶液中的凝血酶；优选使用苯甲脒亲和层析除去溶液中的凝血酶。本专利技术还提供一种利用如上所述的方法制备得到的人胱抑素C。本专利技术还提供一种如上所述的人胱抑素C在制备抗人胱抑素C单克隆抗体中的应用。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：利用本专利技术的基因工程菌制备胱抑素C蛋白时，纯化过程中不会产生胱抑素C蛋白二聚、多聚体，提高了无标签胱抑素C的产量，1L工程菌液中可获得50mg以上的蛋白；且获得的蛋白纯度高，几乎无杂蛋白存在，经SDS-PAGE灰度分析纯度＞97％；进一步获得的不带任何标签的胱抑素C蛋白生物活性良好对于木瓜蛋白酶的抑制活性＞98％，利用其通过免疫Balb/C小鼠以及杂交瘤等技术制备得到的单抗能够识别人血清中胱抑素C且效价高，表明所制备得到高活性胱抑素C为制备单克隆抗体提供了必要的保证，而该单抗能够检出人血清中胱抑素C进一步表明该蛋白及其抗体的质量十分优良，可以作为诊断试剂盒的原料试剂。附图说明图1为重组CystatinC-His在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达后经超声破菌后离心所得产物的SDS-PAGE图；其中，M为蛋白Marker，1：非诱导对照，2：上清，3：沉淀，4：全细胞；重组CystatinC-His蛋白的对应位置在Marker的15～20kDa条带之间。图2为重组CystatinC-His经镍磁珠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产人胱抑素C的基因工程菌，其为在大肠杆菌(Esherichia coli)中表达人胱抑素C的基因的基因工程菌，其特征在于，所述的人胱抑素C的基因的3’端带有表达多肽LVPRGS‑n×His的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。

【技术特征摘要】
1.一种生产人胱抑素C的基因工程菌，其为在大肠杆菌(Esherichiacoli)中表达人胱抑素C的基因的基因工程菌，其特征在于，所述的人胱抑素C的基因的3’端带有表达多肽LVPRGS-n×His的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的人胱抑素C的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；较佳地，所述人胱抑素C基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示；和/或，所述的n为6。3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌携带含有所述人胱抑素C基因的表达载体，所述表达载体的骨架优选质粒pET-22b(+)；和/或，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。4.一种包含人胱抑素C基因的表达载体，所述人胱抑素C基因的3’端带有表达多肽LVPRGS-n×His的基因，其中：4≤n≤8，且所述n为整数。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，述人...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹旭妮，张祎彬，赵剑，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31