本发明专利技术公开了一种高中和活性的寨卡病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药技术领域。本发明专利技术以大肠杆菌表达的寨卡E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期寨卡患者的PBMCs中筛选到可以特异结合寨卡E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT‑PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，进行一系列的功能检测，包括与ZIKE‑E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测，获得了3株具有完全保护寨卡病毒感染的人源单克隆抗体。
A High School Neutralized Human Monoclonal Antibody Against Zhaika Virus and Its Application
【技术实现步骤摘要】
一种高中和活性的寨卡病毒人源单克隆抗体及其应用
本专利技术涉及一种高中和活性的寨卡病毒人源单克隆抗体及其应用，属于医药
技术介绍
越来越多的证据表明寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)可引起新生儿小头症以及神经发育异常，如“格林-巴氏综合征”等。ZIKV，属于黄病毒，主要由蚊虫叮咬传播，但是血液传播，性传播以及母胎传播途径也有报道。1947年，人们首次在乌干达丛林的猕猴分离到ZIKV。该病毒主要流行于非洲以及亚洲的热带地区。2015年，巴西暴发寨卡疫情，随着人群流动扩散至其他国家。目前此次疫情已导致超过60个国家或地区超过80,000例感染病例。然而，针对该病毒仍缺乏有效的疫苗及治疗手段。中和抗体特异性高、能阻断病毒的入侵，是治疗病毒感染的有效手段。黄病毒囊膜蛋白E蛋白介导病毒与宿主细胞的结合和入侵，是病毒最主要的保护性抗原。X-射线晶体学结构显示黄病毒E蛋白有三个结构域：DI，DII和DIII。一般认为DIII负责介导病毒与受体的结合，之前的研究结果表明大多数有效的中和抗体都是识别DIII的中和表位。然而，近期的数据显示病毒表面的E蛋白二聚体以及与相邻二聚体中也存在高中和表位。DII头部(98-110位氨基酸)包含一个高度保守的融合区(fusionloop，FL)，在病毒入侵的膜融合过程中起关键作用。不同黄病毒FL区域保守性非常高，在病毒感染过程中，免疫细胞会产生大量的针对FL的抗体。已有研究发现有一些登革等黄病毒的中和抗体具有广谱中和活性，可以中和寨卡病毒，如：2A10G6、A11、C8等，这些抗体一般结合在保守的融合肽上或附近的区域。最近有报道从寨卡康复病人PBMC中分离到结合在E蛋白DIII的中和抗体。也有利用小鼠杂交瘤细胞，筛选到能够结合DIII的寨卡特异性中和抗体。这些抗体不同程度地能够保护小鼠免受致死剂量的病毒攻击。然而，RNA病毒在抗体压力下，具有高突变的特性，尽管已经有些中和抗体被鉴定，但是更多的针对不同表位的新的抗体对于治疗是必不可少的。本专利技术的目的是鉴定特异的具有保护作用的新的ZIKV中和抗体。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术首先以大肠杆菌表达的ZIKV-E蛋白作为抗原，通过流式分选，从一例康复期ZIKV患者的PBMCs中筛选到可以特异结合ZIKV-E蛋白的记忆B细胞，然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，进行一系列的功能检测，包括与ZIKE-E蛋白的结合力，体外中和效果，体内保护能力等检测，获得了3株具有完全或部分保护寨卡病毒感染的人源单克隆抗体。本专利技术的第一个目的是提供一种抗体，所述抗体命名为Z3L1、Z20或者Z23；其中Z3L1的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:1且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:2，Z20的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:3且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:4，Z23的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:5且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:6。在本专利技术的一种实施方式中，所述Z3L1的重链的核苷酸序列为SEQIDNO:7、轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:8。在本专利技术的一种实施方式中，所述Z20的重链的核苷酸序列为SEQIDNO:9、轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:10。在本专利技术的一种实施方式中，所述Z23的重链的核苷酸序列为SEQIDNO:11、轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:12。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的重链，包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体Z20或者Z23的轻链为κ链，Z3L1的轻链为λ链；轻链包括轻链可变区和轻链恒定区；κ链的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，λ链的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示。本专利技术的三个抗体，来源于同一病患者，并且均靶向寨卡病毒特有的囊膜蛋白-E蛋白，通过抑制E蛋白介导的受体结合和/或膜融合过程，抑制病毒对细胞的感染。本专利技术的第二个目的是提供所述抗体在制备治疗和/或预防寨卡病毒的药物方面的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有所述的人源单克隆抗体Z3L1、Z20和/或Z23。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物组合物还含有医学生可接受的载体。本专利技术的第四个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒中含有所述抗体的抗原，或者编码所述抗原的DNA分子，或者表达所述抗原的重组载体/表达盒/转基因细胞系/重组菌。本专利技术的第五个目的是提供编码所述人源单克隆抗体Z3L1、Z20或者Z23的基因序列。所述抗体的重链，包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示(核苷酸序列如SEQIDNO:14所示)。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述抗体的重链的序列，依次包括CMV启动子序列、EcoRI酶切位点序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、XhoI酶切位点序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的轻链，为κ链和/或λ链；轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述抗体的轻链的序列，依次包括CMV启动子序列、第一酶切位点序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、酶切位点序列XhoI。在本专利技术的一种实施方式中，所述κ链，其轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示(核苷酸序列如SEQIDNO:16所示)，其中第一酶切位点为SacI。在本专利技术的一种实施方式中，所述λ链，其轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示(核苷酸序列如SEQIDNO:18所示)，其中第一酶切位点为EcoRI。在本专利技术的一种实施方式中，所述前导序列的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示(核苷酸序列如SEQIDNO:20所示)。本专利技术还要求保护含有所述基因序列或者表达所述抗体的表达载体、细胞。本专利技术的有益效果：本专利技术获得了3株人源高中和活性的ZIKV抗体：Z3L1、Z20与Z23。这3株抗体与已经报道的ZIKV抗体序列完全不同，是3株新发现的抗体。这三株抗体与ZIKV-E的结合常数分别为5.39μM(Z3L1)，0.16μM(Z20)和0.44μM(Z23)。三株人源抗体均有很强的ZIKV中和活性。并且，Z3L1、Z20与Z23可以完全或部分保护小鼠免受致死剂量的ZIKV的攻击。本专利技术的三株人源抗体有着临床治疗和预防ZIKV的应用价值。附图说明图1：ZIKV-E蛋白纯化分子筛与SDS-PAGE结果；图2：Z3L1纯化的ProteinA(A)及分子筛层析(B)结果；图3：Z20纯化的ProteinA(A)及分子筛层析(B)结果；图4：Z23纯化的ProteinA(A)及分子筛层析(B)结果；图5：Z20(A)、Z23(B)与Z3L1(C与D)与ZIKV-E的动力学曲线；图6：抗体对C6/36扩增的ZIKV的中和曲线；图7：抗体对Vero扩增的ZIKV的中和曲线；图8：三株抗体对感染ZIKV小鼠的保护效果；A为小鼠存活率，B为存活小鼠体重变化。具体实施方式实施例1：寨卡E蛋白的表本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5且轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
【技术特征摘要】
1.一种抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:5且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:6。2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:13所示。3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链，为κ链和/或λ链；轻链包括轻链可变区和轻链恒定区；κ链的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示，λ链的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示。4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1～3任一所述的抗体。5.权利要求1～3任一所述的抗体在制备治疗和/或预防寨卡病毒的药物方面的应用。6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：高福，严景华，王奇慧，仝舟，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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