人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法、产物及其应用制造技术

本发明专利技术为一种人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法、产物及其应用，透过获得被肠病毒71型自然感染的人类病患周边血液，筛选因感染而诱发产生的肠病毒71型特异性免疫球蛋白G分泌B细胞，接着选殖B细胞的免疫球蛋白G变异区基因，并转染到人类细胞株中表现，从而获得人源抗肠病毒71型单克隆抗体，利用上述人源抗肠病毒71型单克隆抗体能专一且强效地中和多种基因亚型的肠病毒71型，特别是那些近年在台湾及中国盛行的肠病毒71型基因亚型B4、C4及B5。

Preparation, Product and Application of Human Monoclonal Antibody Against Enterovirus 71

【技术实现步骤摘要】
人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法、产物及其应用
本专利技术为一种单克隆抗体，尤指一种人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法、产物及其应用。
技术介绍
有效的抗体保护水平是对抗肠病毒71型的重要免疫关键，然而，目前对于人类于自然感染肠病毒71型后所诱发产生的抗体专一性和功能特性的了解相当有限。肠病毒71型(EV71)是一种无外套膜单股RNA为遗传物质的病毒，也是导致欧洲和亚太平洋区的儿童手口足症及疱疹性咽峡炎的主要病原。爆发肠病毒71型疫情时，可能出现侵犯中枢神经的无菌性脑膜炎、似小儿麻痹神经病症、脑炎伴随心肺衰竭、甚至是死亡的个案。2011年，越南爆发严重疫情，导致174，67感染个案及200死亡病例。2012年在中国的疫情，有超过两百万病例及数以百计的死亡案例。2016年，西班牙的疫情有109个确诊严重病例。尽管肠病毒71型的疫情是如此严重，在仍发生疫情的多数国家，都还没有核准上市的疫苗和特定的治疗方法可用来对抗肠病毒71型。肠病毒71型大约每2-3年在流行地区会爆发疫情，有时过去出现过的基因亚型会再度出现，有时会有新的基因亚型出现，取代过去流行的基因亚型。由过去肠病毒71型疫情的病毒株可发现，高突变率和遗传重组率是肠病毒71型的特性之一，曾多次发现肠病毒71型具有基因重组现象，这重组可在同基因型与异基因型之间发生基因交换。肠病毒71型新病毒株或新基因型别的出现，可能是在宿主免疫的压力下，突变的病毒因得以躲避宿主免疫系统的攻击而具有生存优势，并因此感染更多人。台湾于1998年爆发肠病毒71型基因亚型C2的感染时，约有12万以上的被感染个案，并导致了78个死亡病例。经过族群血清学分析，结果显示，缺乏保护抗体是儿童族群高感染率和高重症风险的主要原因之一。在2012年泰国爆发肠病毒71型基因亚型B5的疫情分析，也有类似研究结果。另外，研究显示在一些肠病毒71型感染的小孩中，尽管其抗体反应表现出跨基因亚型的中和效价，但对某些基因亚型其中和效价甚低，或是所产生的抗体对某些基因亚型特别具有偏差性。过去许多研究也显示，宿主的中和抗体促使了病毒的演化。最近的研究显示，小鼠感染肠病毒71型后所产生的抗肠病毒71型单克隆抗体群中，也存在着对不同病毒株或不同基因分型株之的辨识歧异度。然而，我们目前对于人类抗肠病毒71型中和抗体的抗原辨识内容仍不清楚，该议题对于疫苗设计以及未来利用疫苗控制疫情的政策，有着极重要的关联性。越来越多的证据显示，现行开发的肠病毒71型疫苗仍不能交叉保护所有盛行的基因分型及病毒株。肠病毒71型的蛋白质外壳是由其4个基因产物VP1-4所组成的。VP1、VP2和VP3表现在病毒外壳的外侧，而VP4则深埋在内侧。利用小鼠单克隆抗体，可标定出数个肠病毒71型的线性抗原中和决定位(linearneutralizingepitope)，例如在VP1的GH回路(第215-220胺基酸序列)上、在VP2的EF回路(第141-146胺基酸序列)上、及在VP3的Knob区域。研究也显示小鼠单克隆抗体可以辨识特定肠病毒71型病毒株的抗体决定位(位于VP1的第145个胺基酸)。无论如何，小鼠单克隆抗体的肠病毒71型抗原辨识内容无法代表人类儿童体内强效对抗肠病毒71型抗体的抗原辨识内容。至少到目前为止，尚未有任何来自急性肠病毒71型感染下人类所产生的单克隆抗体，与该抗体所辨识的(中和)抗原决定位被详细的报导。一般在肠病毒71型急性感染的儿童病患体内，在感染的第一周时，肠病毒71型特异性的免疫球蛋白G分泌B细胞(plasmablasts)会被大量诱发出来，该抗体分泌细胞反应的高峰期是在临床病征出现后的第4-7天。此外，研究还发现感染后的血清反应内容具有交叉对抗肠病毒71型基因型B和C的中和效价，然而有些感染后血清，有着相对较低的抗肠病毒71型基因型C的抗体效价。现有技术系单克隆抗体是源自BALB/c小鼠，经由去活化肠病毒71型基因亚型C4疫苗施打后，再经杂交瘤细胞株融合技术所产生的单克隆抗体，而杂交瘤细胞株融合技术所产生的小鼠单克隆抗体只针对肠病毒71型基因亚型C4，且其抗原只有单一标的，并未包含其他在台湾及中国流行的肠病毒71型基因亚型B4及B5。目前也有技术选殖抗肠病毒71型的抗体表现基因于酵母菌载体中，并表现及纯化在酵母菌所生产的单克隆抗体，又或者藉由合成肠病毒71型VP1胜肽来免疫小鼠后，选殖其中VP1特异性的抗体免疫基因，并表现于人源化细胞中，生产此基因产物的单克隆抗体，但该单克隆抗体的重链和轻链变异区部分仍是鼠源，此外，鼠源抗体在人体内的效果并不佳，鼠源单克隆抗体亦无清楚标示其作用在肠病毒71型的抗原决定位(epitope)区域。
技术实现思路
本专利技术提供一种人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法、产物及其应用，人源抗肠病毒71型单克隆抗体系按照如下方法改造而成：(1)从已感染肠病毒71型的人类样本血液中，分离出肠病毒71型特异性的免疫球蛋白G分泌B细胞；(2)选殖上述免疫球蛋白G分泌B细胞的免疫球蛋白变异区基因进行重组克隆，再将上述重组克隆的免疫球蛋白G基因转染至HEK293T人类细胞株中，表达免疫球蛋白G并纯化，即可获得人源抗肠病毒71型单克隆抗体。本专利技术的优点在于：(1)本专利技术的人源抗肠病毒71型单克隆抗体是人源抗体，透过肠病毒71型感染后所诱发的人类B细胞所源生的单克隆抗体，相较于现有鼠源单克隆抗体，其中和能力强10-100倍。(2)本专利技术所制造出的人源抗肠病毒71型单克隆抗体，能专一且强效地对抗不同基因亚型的肠病毒71型，例如在中国及台湾主要流行的基因亚型B4、B5、C4等病毒株。(3)本专利技术利用筛选抗体逃脱突变株(escapemutantselection)的技术，对本专利技术的12个人源抗肠病毒71型单克隆抗体作用在肠病毒71型外壳结构上的抗原决定位已进行分析。人源抗肠病毒71型单克隆抗体原本具有中和肠病毒71型的能力，而却对该逃脱病毒株失去中和能力的现象，说明了该逃脱病毒株在被人源抗肠病毒71型单克隆抗体攻击的外壳特定区域上发生了突变，透过定序以及与母株病毒比对，能够定义出逃脱病毒外壳基因的关键突变点。以此方式能明确标示出12个人源抗肠病毒71型单克隆抗体所专一性攻击(中和)病毒的特定区域。(4)透过本专利技术能绘制人源抗肠病毒71型单克隆抗体所辨识的病毒外壳抗原决定位图谱，包括峡谷北部边缘区(canyonnorthernrim)、峡谷底部区(canyonfloor)、峡谷南部边缘区(canyonsouthernrim)、3倍轴高原区(3-foldplateau)、以及2倍轴高原区(2-foldplateau)等五大区域。本专利技术的12株人源抗肠病毒71型单克隆抗体所辨识的抗原决定位，在不同基因型别间相当保守，显示本专利技术的12株人源抗肠病毒71型单克隆抗体具备辨识肠病毒71型的广泛性与交叉互补性；在小鼠脑内攻毒感染肠病毒71型的动物模型显示，人源抗肠病毒71型单克隆抗体16-2-9D(辨识峡谷底部区)和17-2-2B(辨识峡谷边缘区)可以强效防止肠病毒71型基因亚型B5和C4脑内感染小鼠后所引起的神经病变与成长迟缓。(5)本专利技术的人源抗肠病毒71型单克隆抗体的基因可选殖至大肠杆菌的载体或其他宿主细胞中，达到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法，按照如下方法改造而成：(1)从已感染肠病毒71型的人类样本血液中，分离出肠病毒71型特异性免疫球蛋白G分泌B细胞；(2)选殖上述B细胞的免疫球蛋白G变异区基因进行重组克隆，再将上述重组克隆的免疫球蛋白G基因转染至人类细胞株中表达免疫球蛋白G并纯化，即可获得人源抗肠病毒71型单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法，按照如下方法改造而成：(1)从已感染肠病毒71型的人类样本血液中，分离出肠病毒71型特异性免疫球蛋白G分泌B细胞；(2)选殖上述B细胞的免疫球蛋白G变异区基因进行重组克隆，再将上述重组克隆的免疫球蛋白G基因转染至人类细胞株中表达免疫球蛋白G并纯化，即可获得人源抗肠病毒71型单克隆抗体。2.如权利要求1所述的人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法，其特征在于，该人类细胞株系使用HEK293T人类细胞株。3.如权利要求1所述的人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法，其特征在于，所述人源抗肠病毒71型单克隆抗体可用于定义所辨识的肠病毒71型外壳结构区域的抗原决定位，方法如下：(1)利用人源抗肠病毒71型单克隆抗体与肠病毒71型母株作用，并筛选出无法中和的肠病毒71型抗体逃脱株，将其命名为逃脱病毒株；(2)将上述逃脱病毒株与肠病毒71型母株的外壳结构基因进行定序并比较，即可定义出人源抗肠病毒71型单克隆抗体所作用的病毒抗原决定位。4.如权利要求2所述的人源抗肠病毒71型单克隆抗体的制法，其特征在于，所述抗原决定位系标绘于肠病毒71型母株的病毒外壳结构上，包括峡谷北部边缘区、峡谷底部区、峡谷南部边缘区、2倍轴高原区以及3倍轴高原区，位于峡谷北部边缘区为16-2-11B(重链SEQIDNO：4，轻链SEQIDNO：16)、16-3-3C(重链SEQIDNO：7，轻链SEQIDNO：19)和16-2-2D(重链SEQIDNO：8，轻链SEQIDNO：20)，位于峡谷底部区为16-2-8C(重链SEQIDNO：2，轻链SEQIDNO：14)、16-2-9D(重链SEQIDNO：3，轻链SEQIDNO：15)和16-2-12D(重链SEQIDNO：6，轻链SEQIDNO：18)，位于峡谷北部边缘区为16-3-10B(重链SEQIDNO：1，轻链SEQIDNO：13)和17-2-2B(重链SEQIDNO：5，轻链SEQIDNO：17)，位于三倍轴高原区为34-1-6D(重链SEQIDNO：10，轻链SEQIDNO：22)和16-3-4D(重链SEQIDNO：11，轻链SEQIDNO：23)，位于2倍轴高原区为17-1-12A(重链SEQIDNO：9，轻链SEQIDNO：21)和17-2-12A(重链SEQIDNO：12，轻链SEQIDNO：24)。5.如权利要求1所述的人源抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄冠颖，陈奇良，
申请(专利权)人：长庚医疗财团法人林口长庚纪念医院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71