肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用，利用提取EV‑D68病毒基因组RNA，通过反转录和PCR扩增得到VP1基因的cDNA，将其克隆到克隆载体，再转入表达载体得到重组表达质粒，转化宿主菌并用IPTG诱导蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、纯化得到可以作为鉴别诊断抗原的VP1融合蛋白。利用重组VP1蛋白作为免疫原，免疫BALb/c小鼠取免疫小鼠脾脏并将其与骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得了可表达VP1抗体的杂交瘤细胞株，此细胞能够稳定分泌单克隆抗体，通过流式细胞术来检测抗体的免疫原性。本发明专利技术同时获得了VP1单克隆抗体的H链、L链可变区核苷酸及氨基酸序列。

Sequence and Application of Monoclonal Antibody Against Enterovirus Group D 68 VP1

【技术实现步骤摘要】
肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用
：本专利技术属于生物
，涉及一种能特异性针对EVD68-VP1的单克隆抗体，具体涉及所述抗体的可变区序列和流式检测方法。
技术介绍
：肠道病毒D组68型(EnterovirusD68,EV-D68)属于小核糖核酸病毒科，最早于1962年在美国加利福利亚州的下呼吸道感染住院人的咽拭子样本中分离获得。EV-D68病毒感染所致的临床表现多样，从症状较轻的上呼吸道感染到严重的成人和儿童脑膜炎症状。研究表明，EV-D68在儿童中能引起急性迟缓性麻痹及脑神经功能性障碍。近年来，EV-D68病毒在中国及世界范围内均有流行。从2008年-2010年，EV-D68病毒在亚洲、欧洲、美国等地均有小范围流行。2014年12月，在全美47个州和哥伦比亚地区，有1152人被确诊为由EV-D68病毒引起的急性呼吸道感染。在我国，2014年8月，北京儿童医院的一个5岁女童被诊断为EV-D68病毒阳性，随后发展为严重的肺部感染。在中国，Xiang等人通过对2006年8月-2010年4月的6942例与急性呼吸道感染(Acuterespiratorytractinfection，ARTI)相关的成年病人(年龄≥15岁)的鼻拭、咽拭样本检测发现，其中130例样本为肠道病毒感染样本，而感染的肠道病毒以CA21和EV-D68为主，EV-D68感染比例为10％，然而，此报道缺乏儿童ARTI的数据。LU等人对2009年-2012年间的41例儿童肠道病毒感染病例样本检测发现，EV-D68感染病例为7例，比例达17.1％。Xiao等人的另一项研究对中国2012-2014年重庆地区的1876个呼吸道感染的(Respiratorytractinfections,RTD儿童的鼻拭子样本进行检测，发现19例EV-D68感染样本，其中13例样本是在2014年9月到10月检测出，并从样本中分离获得13株病毒，进化树分析发现这13株病毒与2014年的美国主要流行株具有高度同源性。目前，尚无针对EV-D68的有效抗病毒药物及预防性疫苗，所以对人群抗EV-D68抗体的血清学检测，以及研发有效的EV-D68治疗性药物、预防性疫苗是控制EV-D68病毒感染与流行的关键。肠道病毒D68型VP1基因，不仅可以作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且也可以依据VP1基因对小RNA病毒科内不同属进行分类。VP1是EV-D68的主要免疫显性衣壳蛋白，VP1基因全长927bp，含有病毒的主要抗原表位。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术的不足，制备一种针对EVD68-VP1的单克隆抗体，提供单克隆抗体的可变区核苷酸序列及氨基酸序列。并用流式细胞术对抗体进行检测。本专利技术的技术方案为：肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的可变区序列，所述的抗体包括重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL；其中，重链可变结构域VH的核苷酸序列为SEQIDNO：1，氨基酸序列为SEQIDNO：2；重链可变结构域VH依次包含高变区FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3和FRH4，所述的核苷酸序列依次为SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15，所述氨基酸序列依次为SEQID：4、6、8、10、12、14、16；轻链可变结构域VL的核苷酸序列为SEQIDNO：17，氨基酸序列为SEQIDNO：18；轻链可变结构域VL依次包含高变区FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3和FRL4，所述的核苷酸序列依次为SEQIDNO：19、21、23、25、27、29、31所述氨基酸序列依次为SEQID：20、22、24、26、28、30、32。一种抗体或抗原结合片段或多肽，能与EVD68-VP1结合，其包含肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的可变区序列中所述的任一种氨基酸序列。一种抗体或抗原结合片段或多肽，能与EVD68-VP1结合，其序列与所述重链和轻链序列至少有91％和64％的序列相似性。一种基因工程抗体，它所包含的重链和轻链可变区序列与所述的可变区序列一致或具有至少64％的相似性。一种核酸，包含上述的核苷酸序列，包括SEQID:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31。一种抗体或抗原或核酸在研究EVD68时用流式细胞术检测免疫原性中的应用。。本专利技术的有益效果：本专利技术设计了一种高产量的重组人EV-D68VP1的方法，并产生了一种高亲和力的抗VP1单克隆抗体，获得了该抗体的可变区核苷酸序列及氨基酸序列，具有很好的基础研究和临床应用的潜力。附图说明：图1.EVD68-VP1蛋白基因PCR扩增产物电泳图；其中M:DNAmarker；1:PCR产物；图2.EVD68-VP1蛋白基因PCR扩增产物和重组表达质粒pGEX6p-1双酶切胶图(BamH1/XhoI)；其中M:DNAmarker；1:PCR产物；2：载体；图3.EVD68-VP1重组蛋白试表达；其中M:蛋白质marker；1:诱导前；2：诱导后；图4.EVD68-VP1重组蛋白纯化产物的Westernblot分析；其中M:蛋白质marker；1，2：融合蛋白；图5.流式细胞术检测抗体的特异性结合情况。具体实施方式：下面将结合实施例进一步详细地描述本专利技术。然而应当理解，这些附图和实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本专利技术。在本专利技术的构思前提下对本专利技术制备单克隆抗体及其制备方法的简单改造，都属于本专利技术要求保护的范围。以肠道病毒D组68型Fermon株结构蛋白VP1基因为模板，设计引物扩增出目的片段VP1，将其连接至大肠杆菌表达载体pGEX6p-1上。将重组表达载体pGEX6p-1-VP1转化大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)，对该工程菌用IPTG进行诱导表达。菌体裂解后用SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定融合蛋白；对表达菌体进行高压破碎后用8M尿素进行变性，变性蛋白进行亲和层析纯化。通过将全长蛋白作为免疫原多次免疫BALB/c小鼠，待其血清效价达到达到融合要求，取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合制备抗VP1单克隆抗体，在分子水平上进行抗体重链、轻链可变区基因的调取并用流式细胞术鉴定抗体特异性。实施例1：VP1蛋白基因的克隆：使用聚合酶链式反应(PCR)和DNA聚合酶分别从先前构建的含有VP1基因的质粒扩增VP1DNA片段：95℃2分钟，30个循环(95℃20秒，57℃20秒和72℃20秒)，最后在72℃延伸10分钟。引物1CGGGATCCTTAAACCACTTACATGGAGC和引物2CCGCTCGAGTTAGTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGGGTGGTTACTATGTTGTGAGG用于VP1的扩增。PCR扩增产物依次用1％琼脂糖凝胶(Biowest)电泳分析(如图1所示)，用BamH1/XhoI限制酶(NEB)双重消化(酶切后验证如图2所示)，最后克隆到pGEX6p-1(Novagen)中。将最终的构建体命名为pGEX6p-1-VP1，将其转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞(Lifetechnologies)中，分别将其涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的可变区序列，其特征在于所述的抗体包括重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL；其中，重链可变结构域VH的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；重链可变结构域VH依次包含高变区FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3和FRH4，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15，所述氨基酸序列依次为SEQ ID：4、6、8、10、12、14、16；轻链可变结构域VL的核苷酸序列为SEQ ID NO：17，氨基酸序列为SEQ ID NO：18；轻链可变结构域VL依次包含高变区FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3和FRL4，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31所述氨基酸序列依次为SEQ ID：20、22、24、26、28、30、32。

【技术特征摘要】
1.肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的可变区序列，其特征在于所述的抗体包括重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL；其中，重链可变结构域VH的核苷酸序列为SEQIDNO：1，氨基酸序列为SEQIDNO：2；重链可变结构域VH依次包含高变区FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3和FRH4，所述的核苷酸序列依次为SEQIDNO：3、5、7、9、11、13、15，所述氨基酸序列依次为SEQID：4、6、8、10、12、14、16；轻链可变结构域VL的核苷酸序列为SEQIDNO：17，氨基酸序列为SEQIDNO：18；轻链可变结构域VL依次包含高变区FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3和FRL4，所述的核苷酸序列依次为SEQIDNO：19、21、23...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涛，徐亚楠，王志云，刘思华，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12