基因甲基化分析方法、产品和用途技术

本发明专利技术涉及基因甲基化分析方法、产品和用途。提供一种DNA甲基化分析方法，包括1)使含有DNA的生物样品与有核酸吸附能力的载体、裂解液同时接触，将DNA富集于载体上；2)直接使步骤1)获得的吸附有DNA的载体与转化试剂接触从而将载体上富集的DNA的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交上可检测的不同于胞嘧啶的其它碱基，3)再用结合液处理步骤2)得到的混合液，使转化后的DNA再富集于载体上。本发明专利技术还提供相应基因甲基化检测方法、试剂盒和用途。

Analysis methods, products and applications of gene methylation

【技术实现步骤摘要】
基因甲基化分析方法、产品和用途
本专利技术属于基因分析领域。具体而言，本专利技术涉及基因甲基化检测方法、产品和用途。
技术介绍
DNA甲基化是基因转录调控中最重要的表观遗传学修饰之一。这种修饰在与发育和疾病相关的生物学过程中起着重要作用。基因甲基化作为早癌诊断和监测疾病进展的分子标记物，近年来已经设计了多种方法来检测和区分正常和癌症样本中的甲基化序列。这些方法基本都基于核酸提取、亚硫酸氢盐转化、回收后得到的bisDNA(亚硫酸氢盐转化后的DNA)进行检测。当前市面上已出现了多种多样的商业化产品，包括凯杰公司的提取试剂盒、ZYMO公司的转化纯化试剂盒等。当前提取试剂盒主要包括以下几个步骤：样本的前处理；表面活性剂、蛋白酶K等裂解细胞消化蛋白，将DNA从核蛋白上释放出来；采用离心柱或磁珠的方法富集DNA；多次淋洗去除蛋白、多糖等杂质；最后将DNA从固相载体上洗脱下来。转化纯化试剂盒主要包括以下几个步骤：上述提取得到的DNA进行亚硫酸氢盐转化；采用强碱(如氢氧化钠)脱磺酸基；多次淋洗；最后将DNA从固相载体上洗脱下来进行检测。整个过程需要多次淋洗、更换反应管，操作繁琐，且DNA损耗大、污染概率高。商业化试剂盒的上述两个过程相比传统方法有了很大的改进，然而仍需近8个小时的时间才能获得上机检测模板；此外，对于一些肿瘤特异性循环DNA相对稀缺性的样本复杂的操作过程会大大提高核酸的损耗。这对现有的DNA提取和转化处理技术提出了挑战。
技术实现思路
专利技术人通过大量研究，提出一种样品裂解及DNA在有核酸吸附能力的载体上进行富集同步进行、有核酸吸附能力的载体上直接进行DNA转化、再富集及回收检测的单管处理的方法和试剂盒。本专利技术的方法和试剂盒允许在3小时内完成从生物样品到获得上机检测样品的全过程；简化了操作过程，最大程度减少了前处理、漂洗、洗脱、转化、再洗脱等繁琐步骤，减少了过程中DNA的降解和丢失，达到优于传统的甲基化检测处理方法的检测效果。此外，本专利技术的试剂稳定性更高，且更易实现自动化操作。在一些实施方案中，本专利技术提供一种DNA甲基化分析方法，包括1)使含有DNA的生物样品与有核酸吸附能力的载体、裂解液同时接触，将DNA富集于载体上；2)直接使步骤1)获得的吸附有DNA的载体与转化试剂接触从而将载体上富集的DNA的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交上可检测的不同于胞嘧啶的其它碱基，3)再用结合液处理步骤2)得到的混合液，使转化后的DNA再富集于载体上。在一些实施方案中，本专利技术的步骤2)紧接步骤1)进行，即步骤1)和步骤2)之间可以不进行任何其他处理，如洗涤处理等。在一些实施方案中，所述方法的步骤1)还包括添加核酸结合促进剂，使得含有甲基化DNA的生物样品与有核酸吸附能力的载体、核酸结合促进剂和裂解液同时接触，将含有甲基化DNA的核酸富集于载体上。在一些实施方案中，本专利技术的方法中的核酸结合促进剂包括促进裂解液中的核酸与有核酸吸附能力的载体结合的任何试剂，例如其可以是适当的有机溶剂和/或润湿剂。在一些实施方案中，所述核酸结合促进剂包括例如异丙醇、异丁醇、正丁醇、丙酮、吡啶、乙腈、甲酸甲酯、乙酸乙酯、丙二醇、甘油、二甲亚砜、聚乙二醇、烷基硫酸盐、磺酸盐或酯、多元醇表面活性剂(例如司盘类、吐温类表面活性剂)、聚氧乙烯表面活性剂中的一种或多种。在一些实施方案中，可以在本专利技术的方法中使用的裂解液没有特别限制，可以使用本领域中已经采用的适当裂解液。在一些实施方案中，所述裂解液包含胍盐，如盐酸胍、异硫氰酸胍。在一些实施方案中，所述裂解液还可以包含去垢剂如SDS，金属离子螯合剂如EDTA，金属盐如NaCl等中的一种或多种。在一些实施方案中，所述裂解液可以配制成缓冲溶液，如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液。在一些实施方案中，本专利技术的裂解步骤中还可以包括适当的促进核酸从样品释放和分离的试剂，例如本专利技术的方法的1)可以进一步包括使所述含有甲基化DNA的生物样品与蛋白酶如蛋白酶K接触。在一些实施方案中，转化DNA的试剂没有特别限制，可以使用本领域任何使DNA中至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交上可检测的不同于胞嘧啶的其它碱基的适当的试剂。在一些实施方案中，所述转化试剂可以包括亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐或其组合，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵、焦亚硫酸钾、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠中的一种或多种。在一些实施方案中，所述转化试剂可以包括亚硫酸氢钠、亚硫酸钠的混合溶液。在一些实施方案中，本专利技术的方法的转化过程中可以添加任何促进DNA转化的试剂和/或DNA保护剂，例如有DNA保护作用的自由基阱，包括但不限于：氢醌、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸中的一种或多种的有机溶液，如二乙二醇二甲醚溶液、氯仿溶液或四氢呋喃溶液。在一些实施方案中，本专利技术的方法中可以采用任何适当的有核酸吸附能力的载体，包括但不限于：磁珠、非磁性的微球、吸附膜等。在一些实施方案中，有核酸吸附能力的载体包括但不限于：羟基磁珠、羧基磁珠、链霉亲和素免疫磁珠、离子交换树脂等。在一些实施方案中，磁珠的壳层优选氧化硅或琼脂糖。在一些实施方案中，所述磁珠优选超顺磁珠。在一些实施方案中，磁珠粒径可以为100nm～3μm，优选500-1μm。在一些实施方案中，本专利技术方法的步骤2)的转化过程还包括转化后处理步骤，从而制备适于直接进行后续甲基化检测的样品，所述转化后处理步骤包括使用清洗液对转化后的富集于磁珠上的核酸进行清洗的步骤，任选地所述清洗液包括三羟甲基氨基甲烷溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、乙醇溶液，任选地所述清洗液的pH在6～10范围内，优选pH为8～10，优选地所述转化后处理不包括脱磺处理。在一些实施方案中，专利技术人已经发现本专利技术的方法制备的转化样品不需要进行脱磺处理，由此大大节省了实验时间，例如本专利技术的方法中清洗后的样品可以直接进行后续甲基化检测，例如PCR检测、测序检测等。在一些实施方案中，本专利技术的方法制备的转化样品不进行脱磺处理时，可以在PCR检测过程中的预变性阶段增加一段时间的高温处理，例如10-20分钟(例如15分钟)90-98℃(例如95℃)高温处理进行脱磺。在一些实施方案中，本专利技术方法中的生物样品的来源没有特别限制，例如所述生物样品选自任何含有DNA的样品，包括但不限于：无细胞来源的样品或细胞来源的样品；任选的包括但不限于：血液、尿液、粪便、细胞培养液、组织、痰液、胸水、腹水、脑脊液以及这些样品的处理品，任选地所述生物样品可以来自健康受试者和/或患者，例如癌症患者。在一些实施方案中，本专利技术的DNA甲基化分析方法包括对基因组中DNA甲基化的有无和/或模式进行分析的方法。在一些实施方案中，本专利技术的DNA甲基化分析方法包括对基因组中天然存在的和/或异常的DNA甲基化(例如是否存在DNA甲基化和/或DNA甲基化状态是否发生改变)进行分析，可以用于研究DNA甲基化对基因表达的影响等。在一些实施方案中，本专利技术的DNA甲基化分析方法包括制备适合DNA甲基化检测的样品的方法，例如包括对甲基化DNA进行提取、富集和转化和再富集、检测的步骤。在一些实施方案中，本专利技术的DNA甲基化分析方法包括对DNA甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA甲基化分析方法，包括1)使含有DNA的生物样品与有核酸吸附能力的载体、裂解液同时接触，将DNA富集于载体上；2)直接使步骤1)获得的吸附有DNA的载体与转化试剂接触从而将载体上富集的DNA的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交上可检测的不同于胞嘧啶的其它碱基，3)再用结合液处理步骤2)得到的混合液，使转化后的DNA再富集于载体上。

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化分析方法，包括1)使含有DNA的生物样品与有核酸吸附能力的载体、裂解液同时接触，将DNA富集于载体上；2)直接使步骤1)获得的吸附有DNA的载体与转化试剂接触从而将载体上富集的DNA的至少一个未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交上可检测的不同于胞嘧啶的其它碱基，3)再用结合液处理步骤2)得到的混合液，使转化后的DNA再富集于载体上。2.权利要求1所述的方法，其中步骤1)还包括添加核酸结合促进剂，所述核酸结合促进剂包括促进裂解液中的核酸与有核酸吸附能力的载体结合的有机溶剂和/或润湿剂中的至少一种，例如异丙醇、异丁醇、正丁醇、丙酮、吡啶、乙腈、甲酸甲酯、乙酸乙酯、丙二醇、甘油、二甲亚砜、聚乙二醇、烷基硫酸盐、磺酸盐或酯、多元醇表面活性剂(例如司盘类、吐温类表面活性剂)、聚氧乙烯表面活性剂。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述裂解液包含胍盐，如盐酸胍、异硫氰酸胍，任选地还包含去垢剂如SDS，金属离子螯合剂如EDTA，金属盐如NaCl，任选地所述裂解液配制成缓冲溶液，如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液，任选地步骤1)进一步包括使所述含有DNA的生物样品与蛋白酶如蛋白酶K接触。4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述转化试剂包括亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐或其组合，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵、焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠中的一种或多种，例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠的混合溶液。5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤2)的转化过程中还添加有DNA保护作用的自由基阱，包括但不限于：氢醌、6-羟基-2，5，7，8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸中的一种或多种的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，张田田，王冬华，巴兆粉，
申请(专利权)人：江苏为真生物医药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32