利用多重PCR富集目标DNA片段的方法技术

本发明专利技术公开了利用多重PCR富集目标DNA片段的方法。本发明专利技术公开的富集目标DNA片段的方法包括利用满足如下条件的成套引物进行多重PCR富集目标DNA片段：每个引物对的因素J＜50％且9个因素中至多一个因素不在标准范围内；9个因素标准范围：35％≤因素A≤60％；68℃≤因素B≤79℃；30％≤因素C≤70％；30％≤因素D≤70％；15kcal/mol≤因素E的绝对值≤70kcal/mol；因素F的绝对值＜100kcal/mol；因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤因素H的绝对值≤10kcal/mol；因素I＜100℃。利用本发明专利技术的方法可以成功富集基因组中目标DNA片段。

Enrichment of Target DNA Fragments by Multiplex PCR

【技术实现步骤摘要】
利用多重PCR富集目标DNA片段的方法
本专利技术涉及生物
中，利用多重PCR富集目标DNA片段的方法。
技术介绍
高通量测序技术(High-throughputsequencing)又称下一代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)是2004年后新兴的一系列测序技术，能一次平行对大量(几十万到几百万)DNA分子进行序列测定。已经在基因组从头测序、基因组重测序、转录组测序、表观遗传学、单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)开发等等方面，将使基因组学成为研究生物学问题的常规方法，成为人们研究分子生物学、分子遗传学等等的有力工具。在多种新一代测序技术中，Illumina公司开发的基因组分析仪(GenomeAnalyzer,GA)是由隶属英国剑桥大学的Solexa公司建立，是基于边合成边测序(SequencingbySynthesis)原理，由于具有成本相对较低、通量大、前处理较为简单等等优势，是目前使用最广泛的二代测序技术平台。Illumina不断升级GA，特别是HiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq系列测序仪研发完成。IlluminaGA和HiSeq测序平台都需要严格的样品前处理过程，并且不具有选择性，因此，如果对基因组(或转录组)中某一特定的区域感兴趣，则需要在Illumina样品前处理之前对目标区域进行选择性的富集。目前通用的选择性富集的方法包括PCR、MIP(MolecularInversionProbe)和DNA芯片(Microarray)。其中，MIP和DNA芯片技术较为复杂，适合大量群体中目标片段的富集，成本费用高，需要的起始基因组DNA的用量大。并且这些方法都需要建立质量较高的样品文库，从而增加了实验的成本费用。PCR技术是一种具有良好的选择性并且技术要求较低的方法，虽然扩增中会产生核苷酸的突变会在Illumina的样品前处理中放大，造成过多的假阳性结果；但是随着二代测序技术的不断发展(例如IlluminaGA在2006-2012年间更新了6代，IlluminaHiseq在2010-2015年之间更新了7代)，测序的成本费用在不断的降低，测序长度在不断的增加，那么增加测序深度足以能解决由于PCR选择性富集的缺陷。PCR(聚合酶链式反应)是在基因组上设计特异性的引物序列对目标片段进行特异性的扩增。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR(real-timefluorescentquatitativePCR,FQ-PCR)技术、单分子PCR技术和微滴PCR技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何富集基因组中的目标DNA片段。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了利用多重PCR富集目标DNA片段的方法，所述目标DNA片段为n个，n为大于等于2的自然数，所述方法包括：利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：a1)所述成套引物由n个引物对组成；a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；a3)所述成套引物中的每个引物对的9个因素中至多一个因素不在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；所述因素B为引物对的反向引物的TM值，所述因素C为目标片段的GC含量；所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；所述因素E为目标片段的结构自由能；所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；所述9个因素的标准范围如下：35％≤所述因素A≤60％；68℃≤所述因素B≤79℃；30％≤所述因素C≤70％；30％≤所述因素D≤70％；15kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70kcal/mol；所述因素F的绝对值＜100kcal/mol；所述因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10kcal/mol；所述因素I＜100℃。所述成套引物中引物对数与所述目标DNA片段的个数相等。引物对由两条单链DNA组成，一条单链DNA为正向引物，一条为反向引物。所述反向引物是指在进行PCR扩增时沿着正链进行延长的单链DNA或结合序列位于所扩增目的片段下游的单链DNA，所述正向引物是指在进行PCR扩增时沿着负链进行延长的单链DNA或结合序列位于所扩增目的片段上游的单链DNA。所述因素B中，所述引物对的反向引物的TM值，具体为所述反向引物与其识别的单链DNA片段所形成的双链DNA片段的TM值。所述因素J和所述引物I中所述成套引物的其它引物为除所述引物对的反向引物外的所有引物(即除所述引物对的反向引物外的所有单链DNA)。所述目标片段为在利用引物对进行PCR扩增所得的PCR产物。上述方法中，所述成套引物中各引物对的正向引物可含有相同的序列，记为正向引物共同序列；各引物对的反向引物可含有相同的序列，记为反向引物共同序列。上述方法中，所述正向引物共同序列的长度可为h1)或h2)：h1)15-25nt；h2)21nt。所述反向引物共同序列的长度可为i1)或i2)：i1)15-25nt；i2)16nt。上述方法中，所述利用多重PCR富集目标DNA片段的方法还可包括利用第二轮PCR引物对所述PCR产物1进行PCR产物进行扩增实现目标DNA片段的富集，将得到的PCR产物记为PCR产物2；所述第二轮PCR引物的两条引物分别含有所述正向引物共同序列和所述反向引物共同序列。所述正向引物共同序列可为5’-TACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。所述反向引物共同序列可为5’-ATGCCATATTCGCTAG-3’。所述第二轮PCR引物的两条引物还均可含有利用Illumina测序平台测序所用测序引物，将所述第二轮PCR引物的正反向引物中的利用Illumina测序平台测序所用测序引物分别记为引物1和引物2，所述引物1和所述引物2的序列不同。所述第二轮PCR引物的反向引物还可含有标签序列。在本专利技术的一个实施例中，所述第二轮PCR引物的正向引物由所述正向引物共同序列与所述引物1连接得到。所述第二轮PCR引物的反向引物由所述反向引物共同序列、标签序列和所述引物2连接得到。上述方法中，n小于等于100。具体的，n满足如下b1)-b17)中任一条件：b1)2≤n≤60；b2)2≤n≤57；b本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用多重PCR富集目标DNA片段的方法，所述目标DNA片段为n个，n为大于等于2的自然数，所述方法包括：利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：a1)所述成套引物由n个引物对组成；a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；a3)所述成套引物中的每个引物对的9个因素中至多一个因素不在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；所述因素B为引物对的反向引物的TM值，所述因素C为目标片段的GC含量；所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；所述因素E为目标片段的结构自由能；所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；所述9个因素的标准范围如下：35％≤所述因素A≤60％；68℃≤所述因素B≤79℃；30％≤所述因素C≤70％；30％≤所述因素D≤70％；15kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70kcal/mol；所述因素F的绝对值＜100kcal/mol；所述因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10kcal/mol；所述因素I＜100℃。...

【技术特征摘要】
1.利用多重PCR富集目标DNA片段的方法，所述目标DNA片段为n个，n为大于等于2的自然数，所述方法包括：利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：a1)所述成套引物由n个引物对组成；a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；a3)所述成套引物中的每个引物对的9个因素中至多一个因素不在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；所述因素B为引物对的反向引物的TM值，所述因素C为目标片段的GC含量；所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；所述因素E为目标片段的结构自由能；所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；所述9个因素的标准范围如下：35％≤所述因素A≤60％；68℃≤所述因素B≤79℃；30％≤所述因素C≤70％；30％≤所述因素D≤70％；15kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70kcal/mol；所述因素F的绝对值＜100kcal/mol；所述因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10kcal/mol；所述因素I＜100℃。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述成套引物中各引物对的正向引物含有相同的序列，记为正向引物共同序列；各引物对的反向引物含有相同的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆小泉，张英春，池旭，段礼新，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11