本发明专利技术涉及精细化工领域，具体地来说涉及一种基于烯酮式重排的双光子超低背景荧光分子探针的设计合成与应用。荧光探针的合成方法，采用以下步骤：(1)NDN制备：将2‑萘酚溶液加入到氢氧化钠溶液中，处理得无水无氧的试剂；在冰浴中加入重氮盐，搅拌；酸化，烘干，得NDN；(2)荧光探针DNHF‑H2S制备：无水无氧环境下，称取NDN和2，4‑二硝基氟苯加入至DMF中混合均匀；加入碳酸钾，搅拌；升温至40‑60℃，反应；冷却至室温加冰水，抽滤，得荧光探针。此探针双光子成像减少了活体生物样品和荧光团的光损伤，减少了背景吸收和散射，提高了空间分辨率和灵敏度。
A Two-Photon Ultra-Low Background Fluorescence Probe and Its Preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种双光子超低背景荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于分析化学领域，涉及一种双光子超低背景荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
目前可检测硫化氢的传统技术有色谱分析法、比色法、电化学分析法等。这些传统检测技术普遍存在样品用量大且处理过程复杂，对细胞破坏性大，检测过程繁琐等缺点。现阶段可用来检测硫化氢的荧光探针背景荧光干扰过大，选择性较低，而此探针具有双光子超低背景荧光的优点,操作过程简便,因此很有必要开发此探针。
技术实现思路
现阶段可用来检测硫化氢的荧光探针背景荧光干扰过大，选择性较低，而此探针弥补了上述缺陷。此探针结构中的NDN含有萘环结构具有双光子吸收效应，有较好的空间选择性，对样品伤害性也较小；本专利技术的专利技术目的是提供了上述双光子超低背景荧光探针的制备与应用，该荧光探针检测时对细胞损害性小、检测过程简单易操作以及超低背景干扰等优点，广泛应用于生命体或细胞中相关物质的检测。一种双光子超低背景干扰的荧光探针，制备步骤为：(1)NDN的制备重氮盐的制备1)在圆底烧瓶中加入1-3ml蒸馏水和0.5-1.5ml的浓硫酸；2)然后在加入0.5-1.5g的对硝基苯胺，在冰浴下进行搅拌；3)最后在1-3ml的蒸馏水中加入1-1.5g的硝酸钠，慢慢加入到步骤2)制备的溶液中，继续在冰浴下搅拌3-5h。NDN的合成1)2-萘酚7-14mmol溶液，加入1-5M氢氧化钠5-10ml。所用的溶剂需经氩气鼓泡除氧，后经分子筛进一步处理得到无水无氧的溶剂。2)在冰浴中加入重氮盐，搅拌几分钟。3)混合物用1-2M硫酸酸化，产品在40-60℃真空烘干2h，得到产物NDN。(2)荧光探针DNHF-H2S的制备1)该实验在双排管无水无氧环境下进行，称取1.2-1.4mmol的NDN和1.0-1.2mmol的2，4-二硝基氟苯加入至3-7mlDMF中混合均匀2)然后加入1.8-2.2mmol碳酸钾，常温搅拌6h。3)将圆底烧瓶放置于油浴锅中，温度调至40-60℃，继续反应6h。4)待溶液冷却到室温后，加入适量冰水，静止，抽滤。得到的红色固体即荧光探针DNHF-H2S。一种上述双光子超低背景荧光探针的应用，所述探针在检测细胞中H2S含量中的应用。所述荧光探针效果判断指标如下：检测灵敏度：10.5nM；发射波长改变:检测时发射波长向红移70nm；光学机理指标：兼具荧光比率功能及吸收红移功能；荧光分子背景干扰：两次降低荧光背景的干扰，大大提高检测的灵敏度与准确度；反应机理：具有烯酮的重排反应上述方法制备的荧光探针的应用：荧光探针DNHF-H2S具有高灵敏性，可以应用于生物样品中的痕量检测。此探针可以检测细胞内的硫化氢，同时也可实现对细胞内硫化氢浓度变化的监测。荧光探针DNHF-H2S光谱性质的检测，步骤包括：1)配制溶液探针储备液配制：称取适量荧光探针DNHF-H2S溶于DMSO中，配成浓度为1x10-3M储备液，冷藏保存。待测目标物小分子NaHS标准溶液的配制：称取适量NaHS固体溶于适量的蒸馏水中，得到浓度为1x10-3M的标准液。光谱检测溶液体积比为DMSO：PBS缓冲液＝6:12)光谱测定量取10μL荧光探针DNHF-H2S的储备液与0-100μLNaHS标准液，其余加入DMSO与PBS缓冲溶液混合液，配成1mL的溶液，进行光谱测定。荧光光谱测量时固定激发波长370nm；记录。本专利技术荧光探针定性定量分析生物样本中H2S，适合检测细胞中H2S中的含量本专利技术荧光探针检测细胞中H2S含量的方法，步骤包括：1)细胞培养在37℃温度条件下，将HepG2细胞放入含有10％胎牛血清(FBS，invitrogen)的DMEM培养基中，在含有5％CO2气体的湿润培养箱中培育24h。2)细胞毒性试验将培养好的HepG2细胞接种至96孔细胞培养板中继续培养24h。然后加入浓度分别为0μM至30μM(梯度：5μM)的荧光探针DNHF-H2S溶液继续培养细胞24h。然后在每个孔中加入甲基噻唑基四唑(MTT，25μL，5.0mg/mL)溶液在温度为37℃的环境下培育4h。将洗去过量的MTT(甲基噻唑基四唑)溶液样品置于微孔板读数器中，充分震荡(约12min)，在吸收波长470nm处收集数据。根据结果显示，有90％以上的细胞成活。由此说明，此探针具有低毒性，适合于活体细胞成像。3)细胞成像将已培养好的HepG2细胞用pH7.4的PBS缓冲溶液洗涤后加入荧光探针DNHF-H2S(10μM)，继续培养30min。进样前，用PBS缓冲溶液进行洗涤，然后用激光共聚焦显微镜进行细胞成像分析。(激发波长：370nm；收集波长：400-550nm)。与传统检测技术相比，该荧光探针弥补了上述缺陷，具有样品用量少且无须预处理、对细胞损害性小、检测过程简单易操作以及超低背景干扰等优点，因此适合广泛应用于生命体或细胞中相关物质的检测。本专利技术制备的荧光探针检测机理:原理为：NDN光稳定性较高，且含有强吸电子基硝基,大大降低了背景荧光的干扰；而且NDN中含有萘环,具有双光子吸收的特征,有良好的空间选择性,对样品伤害较小；故可将其改造为检测H2S的荧光探针的母体发光环。因2，4-二硝基氟苯对硫化氢具有特异性的识别功能，因此选取2，4-二硝基氟苯为反应基团。同时，2，4二硝基氟苯中的强吸电子基，可以将NDN的荧光淬灭，从而消除了荧光分子探针背景的干扰。在无水DMF中NDN与2，4-二硝基氟苯反应制得荧光探针DNHF-H2S。当H2S存在时，2，4-二硝基氟苯结构会迅速与H2S反应，同时伴随荧光打开。又因H2S的强还原性，使得NDN母体环上的硝基也被还原，并且发生重排反应,荧光强度进一步增加。本专利技术技术方案有益效果为：1)提高检测的灵敏性本专利技术在不加任何其他附加材料的条件下，提高了检测灵敏性，并且避免了添加附加材料，减少附加材料的消耗以及减少了在检测中的误差中的来源。2)超低荧光背景NDN本身就含有强吸电子基硝基，减少了发光母体环本身的荧光背景，而且2，4-二硝基氟苯中也含有强吸电子基硝基，可以将NDN的荧光淬灭，从而大大降低了荧光分子探针背景的干扰。3)双光子吸收效应NDN中含有萘环，具有双光子吸收的特征，具有良好的空间选择性，对样品伤害较小。4)对待测物的高选择性。实验结果表明，在荧光探针的缓冲溶液中，只有加入NaHS时，才会导致荧光强度的明显增强，而其他的离子并未引起荧光强度的明显增强。5)可用于细胞内成像分析本专利技术的探针可以检测细胞内的硫化氢，同时也可实现对细胞内硫化氢浓度变化的监测。附图说明图1为本专利技术双光子超低背景的H2S荧光探针检测及发光原理示意图；图2探针的H谱；图3探针的C谱；图4荧光探针DNHF-H2S的单晶结构；图5细胞的共聚焦成像，a：蓝色通道b：明场c：a与b场的叠加；图6在不同条件下，荧光探针DNHF-H2S(10μM)与待测物NaHS(400μM)反应的荧光响应；图7干扰离子(100μM)对荧光探针DNHF-H2S(10μM)荧光强度的影响；图8荧光探针DNHF-H2S(10μM)与300μM的NaHS的反应时间响应图；图9荧光探针DNHF-H2S(10μM)与400μM的NaHS的在不同温度下反应的荧光强度；图10a：荧光探针DNHF-H2S(1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双光子超低背景荧光探针，其特征在于，荧光探针中荧光染料结构式如式（Ⅰ）所示：
【技术特征摘要】
1.一种双光子超低背景荧光探针，其特征在于，荧光探针中荧光染料结构式如式（Ⅰ）所示：DNHF-H2S(Ⅰ)。2.一种权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于，采用以下步骤：(1)NDN的制备1）将2-萘酚溶液加入到氢氧化钠溶液中，处理得到无水无氧的试剂；2）在冰浴中将重氮盐加入步骤1）所述的无水无氧的试剂中，搅拌；3）将步骤2）制备的混合物酸化，烘干，得到产物NDN；(2)荧光探针DNHF-H2S的制备1）在无水无氧环境下，称取1.2-1.4mmol的NDN和1.0-1.2mmol2，4-二硝基氟苯加入至3-7mlDMF中混合均匀；2）在步骤1）中加入1.8-2.2mmol碳酸钾，搅拌；3）升温至40-60℃，继续反应；4）冷却至室温后，加入冰水，抽滤，得到的红色固体即荧光探针DNHF-H2S。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）NDN的制备中1）所述的2-萘酚的物质的量为7-14mmol，氢氧化钠溶液的浓度为1-5M，体积为5-10ml；步骤（1）NDN的制备重氮盐的物质的量6.7-13.3mmol；中3）中酸化使用的为硫酸，所述的硫酸的浓度为0.5-1.5M。4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）NDN的制备中3）的烘干为40-60℃真空烘干2h。5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述步骤（2）荧光探针DNHF-H2S的制备中2）所述的搅拌为常温搅拌6h；所述（2）荧光探针DNHF-H2S的制备中3）继续反应3h。6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）NDN的制备中2）所述的重氮盐的制备方法为：1）在圆底烧瓶中加入蒸馏水和浓...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈光，李璐，许洁，薛俊莲，胡金莲，姜翱，刘玉霞，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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