无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术提供一种无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法，该方法包括如下步骤：1)提供细胞；2)采用内质网荧光探针以及与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料对收集的细胞进行染色；3)根据靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异，快速筛选得到胎儿滋养层细胞；4)通过细胞分选平台挑取得到目标细胞。5)得到的目标细胞用于单基因性疾病的产前诊断。本发明专利技术首次开创了一种从孕妇分泌物中获取胎儿细胞的新方法，操作步骤简单、耗时短、获取细胞个数稳定、纯度高、获取的胎儿滋养层细胞具有完整的胎儿基因组；在较低成本的基础上获取足够纯的胎儿基因组，且完全无创，适用于产前诊断α‑地中海贫血、β‑地中海贫血以及其他单基因性疾病。

A Kit for Noninvasive Acquisition of Fetal Rare Cells and Its Method

【技术实现步骤摘要】
无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法
本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法。
技术介绍
地中海贫血(thalassemia)，即珠蛋白生成障碍性贫血，又称海洋性贫血，是由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋白链合成减少或缺如，从而导致的一组遗传性溶血性疾病，是一组严重威胁健康的致残、致死性遗传血液病。地中海贫血是全球分布最广、累积人数最多的常染色体隐性遗传疾病。根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，可分为α-地中海贫血、β-地中海贫血、γ-地中海贫血、δ-地中海贫血、δβ-地中海贫血等，其中α-地中海贫血和β-地中海贫血最常见。在我国南方地区，地中海贫血的发病率很高，α-地中海贫血的发病率在广东、广西分别可达到3.18-9.46％、9.47-14.13％，而β-地中海贫血的发病率则可分别达到1.50-3.56％、3.57-6.78％。此病目前缺乏有效治疗手段，应用羊水穿刺、绒毛膜穿刺等产前诊断技术阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。α-地中海贫血主要由α-珠蛋白基因发生缺失所引起，并且缺失范围具有很大的异质性，可以是仅涉及2个α-基因附近的几千个碱基对的缺失，更多的是包含2个α-基因在内的涉及几万到几十万碱基对的缺失，甚至整个α-珠蛋白基因簇的丢失。此外，还有只包含α-基因上游调控区的片段缺失。中国人最常见的是(--SEA/)缺失突变、(-α3.7/)缺失突变和(-α4.2/)缺失突变。而β-地贫是由于血红蛋白的β珠蛋白基因的点突变导致β珠蛋白肽链缺如(β°)或合成不足(β+)，从而引起的遗传性溶血性贫血病。目前全球范围内已报道170种左右β珠蛋白基因的突变型，其中导致中国人群β地贫发生的突变基因有28种，最主要的有6种，包括：CD41-42(-4bp)、IVS-II-654(C-T)、CD17(A-T)、CD71-72(+A)、-28(A-G)以及CD26(G-A)。地中海贫血中这些大范围的片段缺失突变以及点突变的特点决定了在进行该病筛查和诊断时必须获得高质量、高纯度的DNA，才能满足下游的PCR及杂交、测序等反应过程。目前为止，诊断胎儿遗传性疾病的金标准为侵入性的检测手段，如羊膜腔穿刺术(胎龄>16周)、绒毛膜绒毛取样(胎龄10～12周)等，收集的胎儿细胞用于染色体核型及基因分析。这些检测手段能为临床决策提供准确的信息，但这些检测手段为侵入性检测手段，存在增加流产风险(0.6～2％)、给孕妇造成创伤等不利因素。在临床中，并不是所有的风险孕妇都愿意接受这些有创的产前诊断方法。而在无创产前诊断的方法中，血浆游离胎儿DNA的检测被证明在胎儿非整倍体疾病(21-三体、18-三体、13-三体)诊断中具有良好的灵敏性。然而，血浆游离胎儿DNA片段化严重，且易受大量的母体DNA污染，这限制了它用于其他遗传性疾病如微缺失、微重复及点突变等的诊断，使血浆游离胎儿DNA的检测成为一种筛查手段，而不是一种诊断手段。现有技术中，临床上用于地贫等单基因疾病产前检测的技术均以有创穿刺为基础，均为获取胎儿DNA之后的检测技术，而对于如何通过无创手段获取纯的、完整的胎儿DNA的技术尚无，更未出现以胎儿稀有细胞为基础的无创产前诊断技术或产品。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于孕妇拭子获取胎儿稀有细胞的试剂盒及其方法，用于解决现有技术中胎儿稀有细胞的获取具有有创性、易污染等问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种基于孕妇拭子获取胎儿稀有细胞的方法，包括如下步骤：1)提供细胞；2)采用内质网荧光探针以及与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料对靶滋养层细胞进行染色；3)根据靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异，筛选得到胎儿滋养层细胞；4)通过细胞分选平台挑取得到目标细胞。可选地，所述步骤1)中，所述细胞来源于孕妇产道。可选地，所述步骤1)中，所述细胞是通过无创的方式从孕妇产道中获得。可选地，所述步骤1)中，所述细胞是通过棉签拭子或巴氏涂片从孕妇产道中获得。可选地，所述步骤1)中，所述孕妇的孕周为5～25周，具体可以为5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、21周、22周、23周、24周、25周等。通常，25周以后意义不大，5周以前胚胎发育未稳，不建议做标本获取。可选地，所述步骤1)中，将拭子上脱下的细胞制成细胞悬液，离心弃去上清后，过滤去除鳞状上皮细胞。可选地，所述步骤1)中，采用30μm孔隙的滤网过滤。可选地，所述步骤2)中，所述内质网荧光探针选自ER-TrackerRed、ER-TrackerGreen中的至少一种，该内质网荧光探针可从市场上购买得到。可选地，所述步骤2)中，所述细胞荧光染料选自DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、Hoechst33342中的至少一种，该细胞荧光染料可从市场上购买得到。可选地，所述步骤3)中，在高倍镜视野下观察、确认、拍照，使用ImageJ软件对每一个细胞进行细胞圈取，自动荧光强度定量，并计算靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异。可选地，所述步骤3)中，靶细胞荧光强度/背景细胞平均荧光强度≥3时，认为靶细胞荧光为强阳性，靶细胞用于下一步的单细胞挑取。检测限如果降低太多，易造成非特异性细胞的污染，以平均值为3的阈值界限较为合适。可选地，所述步骤4)中，采用CellCelectorTM全自动细胞筛选系统挑取细胞。可选地，所述步骤4)中，采用装有细胞裂解液的试剂管回收挑取的单细胞。可选地，还包括步骤5)稀有胎儿滋养层细胞的全基因组扩增与鉴定.可选地，所述步骤5)包括如下步骤：51)单细胞多次退火环状循环扩增；52)短串联重复序列(Shorttandemrepeat，STR)分析和/或单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)分析，得到来源于胎儿的滋养层细胞。可选地，所述步骤51)包括细胞裂解、挑取单个细胞、孵育样本、预扩增、扩增。本专利技术还提供一种无创获取胎儿稀有细胞的试剂盒，包括内质网荧光探针、与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料。可选地，所述内质网荧光探针选自ER-TrackerRed。可选地，所述细胞荧光染料选自DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)。可选地，还包括细胞裂解液。可选地，所述细胞裂解液包括CellLysisBuffer、CellLysisEnzyme。可选地，还包括预扩增混合液。可选地，所述预扩增混合液包括Pre-AmpBuffer、Pre-AmpEnzymeMix。可选地，还包括扩增混合液。可选地，所述扩增混合液包括AmplificationBuffer、AmpEnzymeMix。可选地，还包括短串联重复序列分析体系。可选地，所述短串联重复序列分析体系包括215×MasterMix、215×PrimerPairMix。可选地，还包括上样混合物。可选地，所述上样混合物包括WENILS500、Hi-DiTMformamide。可选地，还包括单核苷酸多态性分析体系。可选地，所述单核苷酸多态性分析体系包括TaKaRaTaqHS、10×PCRBuffer、dNT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无创获取胎儿稀有细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供细胞；2)采用内质网荧光探针以及与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料对靶滋养层细胞进行染色及快速鉴定；3)根据靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异，筛选得到胎儿滋养层细胞；4)通过细胞分选平台挑取得到目标细胞。

【技术特征摘要】
1.一种无创获取胎儿稀有细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供细胞；2)采用内质网荧光探针以及与所述内质网荧光探针不同颜色的细胞荧光染料对靶滋养层细胞进行染色及快速鉴定；3)根据靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异，筛选得到胎儿滋养层细胞；4)通过细胞分选平台挑取得到目标细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述细胞来源于孕妇，优选地，所述细胞是通过无创的方式从孕妇，更优选地，所述细胞是通过棉签拭子或巴氏涂片从孕妇产道中获得；和/或，所述步骤1)中，所述孕妇的孕周为5～25周；和/或，所述步骤2)中，所述内质网荧光探针选自ER-TrackerRed、ER-TrackerGreen中的至少一种；和/或，所述步骤2)中，所述细胞荧光染料选自DAPI、Hoechst33342中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，在高倍镜视野下观察、确认、拍照，使用ImageJ软件对每一个细胞进行细胞圈取，自动荧光强度定量，并计算靶细胞与背景细胞之间的荧光强度差异；和/或，所述步骤3)中，靶细胞荧光强度/背景细胞平均荧光强度≥3时，认为靶细胞荧光为强阳性，靶细胞用于下一步的单细胞挑取；和/或，所述步骤4)中，采用CellCelectorTM全自动细胞筛选系统挑取细胞；和/或，所述步骤4)中，采用装有细胞裂解液的试剂管回收挑取的单细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括步骤5)稀有胎儿滋养层细胞的全基因组扩增与鉴定。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤5)包括如下步骤：51)单细胞多次退火环状循环扩增；52)短串联重复序列分析和/或单核苷酸多态性分析，得到来源于胎儿的滋养层...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑磊，黄一芳，司徒博，叶昕怡，江秀娟，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东,44