一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法技术

本发明专利技术公开了一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法。本发明专利技术提供了一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法，包括如下步骤：向贴壁培养的汇合率为85％‑90％的鸡胚胎原代成纤维细胞中加入终浓度100ng/ml的诺考达唑，进行阻抑培养4h，然后轻拍培养皿使M期细胞脱落后离心收集G2/M期细胞。本发明专利技术实验证明，本发明专利技术利用诺考达唑(100ng/ml)阻断法和机械震荡法相结合，可使鸡胚胎原代成纤维细胞同步化至G2/M期的比例高达95.62％。

An Efficient Method for G2/M Synchronization of Primary Chicken Embryo Fibroblasts

【技术实现步骤摘要】
一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法
本专利技术属于生物
，涉及一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法，尤其涉及一种适用于染色体分选的高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法。
技术介绍
连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为一个细胞周期(cellcyc1e)。整个细胞周期可分为间期和有丝分裂期，M期即为有丝分裂期，是染色体真正开始分离时期。间期又可进一步细分为G1期、S期、G2期3个时相。在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中只有少数细胞在进行有丝分裂活动(M期)，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。为了获取特定阶段的生化材料，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质。获得M期细胞方法从理化角度可分为化学阻断法和物理选择法两类。化学阻断法是利用某些特定的化学试剂破坏微管的形成，将细胞阻断在M期。常用的阻断药物有秋水仙素，秋水仙胺、诺考达唑等。化学阻断方法的缺点是这些阻断试剂都会有一定毒性，如果作用浓度或作用时间不合适，会造成细胞产生异常分裂，生长畸形甚至死亡。不同物种的不同类型细胞，对这些化学阻断试剂的耐受性是不一样的，因此对不同物种不同类型的细胞获得G2/M期细胞的最佳阻抑浓度及最佳阻抑时间通常需要进行大量的试验摸索。G2/M期细胞物理选择法是利用处于M期细胞会变圆隆起，与培养皿的附着性低的特性，经轻轻振荡，M期细胞易脱离器壁，悬浮于培养液中，可收集培养液而获得所需的M期细胞。物理选择法的缺点是贴壁培养细胞处于分裂期的细胞数量极少，不能实现短期大量收集M期细胞，且若振荡幅度过大可能收集到间期细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：向贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞中加入终浓度100ng/ml的诺考达唑，进行阻抑培养4h后，轻拍培养皿，收集脱落的细胞得到G2/M期细胞。上述方法中，所述加入终浓度100ng/ml的诺考达唑的时机为待贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞汇合率85﹪－90﹪时。上述方法中，所述阻抑培养的时间为4h小时。上述方法中，所述鸡胚胎原代成纤维细胞培养所用的培养基由体积百分含量20％的FBS和体积百分含量80﹪的DMEM/F12培养基组成。上述方法中，在所述阻抑培养4h后，震荡收集鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期细胞；所述震荡收集为先拍打培养皿使G2/M期细胞脱落，再离心收集。上述方法中，所述鸡胚胎原代成纤维细胞为第1-10代中任一代细胞。由上述方法制备的G2/M期细胞也是本专利技术保护的范围。细胞增殖的过程称为细胞周期，在细胞周期中，最主要的事件是遗传信息的载体DNA复制成两份拷贝，并通过有丝分裂的方式将两份拷贝分配到两个子代细胞内。增殖型细胞的细胞周期分为4期,其中关键的两期为DNA合成(S)期和细胞分裂(M)期；在M期结束后和S期开始前的间隙期称为G1期,而在S期结束后和M期开始前的间隙期称为G2期。G2期和M期的细胞已经经历了S期DNA的复制，因此G2/M期细胞DNA的含量为G1期细胞的2倍，而处于G1期之后G2/M期之前的S期为细胞DNA的合成时期，其细胞DNA的含量一般大于G1期细胞而小于G2/M期细胞。用流式细胞术(FlowCytometry,FCM)进行细胞周期分析是通过测定细胞中DNA量而完成的。测定DNA含量后，可用FCM配备的细胞周期分析软件(例如BectonDickinson公司的ModFit软件和Flowjo软件)对其进行自动分析。此测定的细胞周期按照DNA的量分可为G1期、S期及G2/M期。本专利技术确定了诺考达唑对鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期同步化最优作用浓度，并结合物理方法，形成了一种高效同步化鸡胚胎原代成纤维细胞至G2/M期的方法，G2/M期的同步化效率高达95.62％，为后期大量中期染色体的制备及染色体流式分选奠定了基础。本试验所优化的诺考达唑加入时机，作用浓度和作用时间适用于鸡胚胎原代成纤维细胞。大量M期细胞的获得可制备大量的鸡中期染色体，用于其它后续实验，如染色体核型分析，特异染色体的分选，特异染色体的荧光原位杂交等。附图说明图1为诺考达唑处理和未经诺考达唑处理的鸡胚胎原代成纤维细胞。(a)为未加诺考达唑处理的正常鸡胚胎原代成纤维细胞；(b)为诺考达唑(终浓度100ng/ml)处理的试验组鸡胚胎原代成纤维细胞。图2为不同浓度诺考达唑处理鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期细胞所占比例对比图。图3为鸡胚胎原代成纤维细胞经不同处理后各细胞样品细胞周期分布图。(A)为未经诺考达唑处理的正常贴壁生长的鸡胚胎原代成纤维细胞各细胞周期分布图；(B)为只经诺考达唑(终浓度100ng/ml)阻抑而未经机械震荡直接收集的细胞各细胞周期分布图；(C)为经诺考达唑(终浓度100ng/ml)阻抑后机械振动剥离的细胞样品各细胞周期分布图。图4为鸡胚胎原代成纤维细胞经不同处理后各细胞周期比例。对照组1：未经诺考达唑处理的正常贴壁细胞；对照组2：只经诺考达唑(终浓度100ng/ml)阻抑后未经机械振荡而直接收集的细胞；试验组：经诺考达唑(终浓度100ng/ml)阻抑后机械震荡的试验组收集的细胞。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，其余试剂均可从商业途径得到。下面实施例中所用的培养基配方为体积百分含量为20﹪FBS+体积百分含量为80﹪DMEM/F12培养基。实施例1、鸡胚胎原代成纤维细胞的分离与培养从无菌鸡胚胎分离鸡胚胎原代成纤维细胞，并传代贴壁培养，具体方法如下：(1)鸡蛋表面消毒后，置于无菌超净台中；(2)用镊子钝端轻轻敲碎气室端的蛋壳，用无菌镊子将其中鸡胚取出，置于无菌培养皿中；(3)用无菌剪刀去除胚胎的头和四肢，将躯干部尽量剪碎；(4)将剪碎的躯干部组织转移到无菌15ml离心管中，加入10ml浓度为0.25﹪的胰蛋白酶，置于37℃恒温水浴锅中消化15-20min，1000rpm离心6min,弃掉胰酶上清；(5)加入1ml完全培养基，将沉淀悬浮后经40μm无菌细胞筛过滤，滤液置于直径10cm无菌培养皿中，滤液中即含有大量的分离出的鸡胚胎原代成纤维细胞；(6)向步骤(5)中含有鸡胚胎原代成纤维细胞的培养皿中加入适量完全培养基，置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养；(7)鸡胚胎原代成纤维细胞的纯化：初分离的鸡胚细胞往往含有多种细胞类型，应用胰酶差速消化法纯化鸡胚胎原代成纤维细胞，一般传代至3-4代可获得较纯的鸡胚胎原代成纤维细胞。分离纯化的鸡胚胎原代成纤维细胞结果如图1(a)所示。实施例2、诺考达唑阻抑鸡胚胎原代成纤维细胞于G2/M期的条件优化将传代至2-10代次的鸡胚胎原代成纤维细胞，用不同浓度诺考达唑进行阻断，探索获得最大比例G2/M期鸡胚胎原代成纤维细胞的诺考达唑作用浓度，具体方法如下：一、不同浓度诺考达唑阻抑处理1、将接种第4代鸡胚胎原代成纤维细胞的培养皿分为7组，每组3个重复。2、检测细胞汇合率，显微镜下观察贴壁细胞在培养皿底部的贴壁面积，贴壁面积约占整个培养皿面积的85％-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种获得鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期细胞的方法，包括如下步骤：向贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞中加入终浓度100ng/ml的诺考达唑，进行阻抑培养，得到G2/M期细胞。

【技术特征摘要】
1.一种获得鸡胚胎原代成纤维细胞G2/M期细胞的方法，包括如下步骤：向贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞中加入终浓度100ng/ml的诺考达唑，进行阻抑培养，得到G2/M期细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述加入终浓度100ng/ml的诺考达唑的时间为待贴壁培养的鸡胚胎原代成纤维细胞汇合率85﹪－90﹪时。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述阻抑培养的时间为4小时。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述鸡胚胎原代...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓学梅，姚延珠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11