鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法。本发明专利技术将鸡胚成纤维细胞细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞；本发明专利技术进一步提供了一种制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)将所述适应无血清培养基呈悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的细胞接种IBDV病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液；(3)将病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，即得。本发明专利技术制备方法降低了污染风险和生产成本，有效缩短了疫苗的生产时间，便于进行扩大生产规模；所制备的鸡传染性法氏囊病毒活疫苗安全性好，具有良好免疫保护效力。

【技术实现步骤摘要】
鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
本专利技术涉及鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法，尤其涉及采用无血清悬浮培养技术制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，属于鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备领域。
技术介绍
传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、溶淋巴细胞性传染病，主要感染3～6周龄的青年鸡。该病毒主要侵害雏鸡法氏囊内未成熟的B淋巴细胞或B淋巴前体细胞，使鸡群产生严重、长期的免疫抑制，使机体对疫苗应答能力的下降，引起免疫失败，或导致其他病毒性或细菌性疾病的继发感染性，从而增加了鸡群的死淘率。本病仍无有效的治疗方法，免疫接种一直是防治IBD的最佳选择。近年来变异株和超强毒株的存在使本病的预防工作更加复杂，采用免疫接种结合综合防制仍是预防本病最有效措施。DF-1细胞起源于鸡胚成纤维细胞，现已经成为一种成熟的传代细胞系。DF-1细胞体外培养具有很强的增殖能力，其细胞的密度能够超过CEF4倍以上。DF-1细胞是逆转录酶阴性、非致瘤性的细胞。DF-1细胞系是经美国食品与药物管理局(FDA)授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。传统的DF-1培养大多采用血清贴壁的方式，该培养方式工艺复杂，占地面积大，需大量人工操作并且在培养过程中需要添加血清，增加了被外源病毒、支原体等污染的可能性，而且不同批次间的血清差异也会导致产品质量难以控制，同时也加大了下游分离纯化的难度。与血清贴壁培养技术相比，无血清悬浮培养技术无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，降低了污染风险和生产成本，缩短了生产时间。由于无血清悬浮培养技术不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。因此，无血清悬浮培养技术是细胞工业化生产疫苗的必然趋势。因此，将DF-1细胞进行全悬浮驯化培养获得适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的细胞以及将其应用于鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备，对于降低鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的生产成本和污染风险、进行规模化生产等均具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞；本专利技术的目的之二是应用所驯化获得的适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞(DF-1细胞)制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗，该制备方法采用悬浮培养技术降低鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的生产成本和污染风险，能够进行规模化工业生产。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术将传代鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得一株适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，该细胞被命名为DF-1-XF。本专利技术首先采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养：本专利技术将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中；经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养；以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，仅有个别细胞呈现出稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态；本专利技术经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1细胞命名为DF-1-XF细胞。本专利技术将驯化培养获得适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.16295，分类命名是：适应全悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞；保藏日期是：2018年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理中心普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术进一步的应用所述的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗，所述方法包括：(1)将DF-1-XF细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种IBDV病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，(3)将病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。本专利技术将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75×106cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×106cells/ml，培养48小时细胞密度可3.0×106cells/ml以上，适合大生产需求；因此，步骤(1)将DF-1-XF细胞优选按照0.75×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；另外，步骤(1)中所述的细胞悬浮增殖培养条件还包括：pH值、溶氧、培养温度和搅拌转速等条件，这些参数均可以采用常规的细胞悬浮培养的参数进行培养，作为参考，所述pH可以控制为7.2、溶氧值可以控制为(DO)为50％、温度可以控制为37℃、搅拌转速可以控制为50-500r/min。本专利技术在血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×106个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃的条件下，将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果发现，当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度达到3.2×106cells/ml；因此，在步骤(1)中进行细胞悬浮增殖培养时，所采用的搅拌转速优选为100r/min。将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36小时、48小时和60小时按2v/v％接种IBDV病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.将鸡胚成纤维细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.16295。

【技术特征摘要】
1.将鸡胚成纤维细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCCNo.16295。2.权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞细胞在制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的应用。3.一种制备鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡传染性法氏囊病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，(3)将收获的病毒液与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到鸡传染性法氏囊病毒活疫苗。4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞按照初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml或0.75×106cells/ml的接种密度接种于生物反应器或细胞培养瓶中进行悬浮培养；优选的，步骤(1)中将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞按照初始密度为0.75×106cells/ml的接种密度接种于生物反应器或细胞培养瓶中进行悬浮培养。5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将权利要求1所述的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中在搅拌的条件下进行细胞悬浮增殖培养；其中，所采用的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鑫莹，杨末，赵晓春，柴华，赵刚，李建华，李应鹤，陈琳，王宁，曲海波，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23