用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法技术

提供用于促进多能干细胞的增殖的方法、和用于此的促进增殖组合物。一个实施方式是一种促进增殖组合物，其用于促进多能干细胞的增殖，其包含血凝素或其变体。另一个实施方式是一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括在添加了本公开所涉及的促进增殖组合物的培养基中培养多能干细胞。

Compositions for promoting proliferation of pluripotent stem cells and methods for promoting proliferation of pluripotent stem cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法
本公开涉及用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法。
技术介绍
包括再生医疗在内的干细胞产业中，需要将多能干细胞维持其未分化状态进行大量培养。专利文献1为了在维持iPS细胞等多能干细胞的未分化状态的同时使其增殖，公开了在激活素的存在下培养多能干细胞。另一方面，专利文献2和3公开了使用血凝素和其变体而去除在多样性干细胞的培养中产生的脱离未分化状态的细胞的方法。此外，专利文献3公开了使用血凝素而将多样性干细胞的悬浮培养中的细胞团块分割为小块的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2012-143229号公报专利文献2：WO2014/104207专利文献3：WO2015/199243
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题本公开提供用于促进多能干细胞的增殖的组合物、和促进多能干细胞的增殖的方法。用于解决问题的技术方案本公开在一个实施方式中，涉及一种促进增殖组合物，其用于促进多能干细胞的增殖，包含血凝素或其变体作为有效成分。本公开在另一个实施方式中，涉及一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括在添加了本公开所涉及的促进增殖组合物的培养基中培养多能干细胞。本公开在另一个实施方式中，涉及一种多能干细胞的培养方法，其包括进行本公开所涉及的促进增殖的方法。专利技术效果根据本公开，在一个或多个实施方式中，能够实现可以在维持其未分化状态的情况下促进多能干细胞的增殖的效果。附图说明图1是确认源自人iPS细胞的单一细胞的克隆细胞培养中的血凝素(HA)的促进增殖效果的结果图。图2是实施例中的实验方案的概略图。图3是将人iPS细胞的细胞团块的悬浮培养中的培养时间与细胞密度描点而得到的图。图4是确认人iPS细胞的细胞团块的悬浮培养中的血凝素(HA)的影响的显微镜观察照片的结果图。图5是确认HA添加对细胞团块中的细胞数的影响的图的一例。〇：未添加HA、△：添加5mMHA、□：添加10mMHA。图6是细胞团块内部的可分裂细胞的不均匀性的荧光染色显微镜观察的结果的一例。具体实施方式本申请专利技术人等参与开发去除在多能干细胞的培养中产生的“脱离未分化状态的细胞”的技术。“脱离未分化状态的细胞”具有在培养中的多能干细胞的集落中央部或集落周边部产生的倾向。并且表明，通过向培养中的集落添加血凝素，能够去除在集落中央部已产生/将产生的“脱离未分化状态的细胞”等(WO2014/104207和WO2015/199243)。此外表明，如果向将多能干细胞悬浮培养而形成的细胞团块添加血凝素，则能够将该细胞团块容易地分割为小块(WO2015/199243)。据推测，这些结果所依据的机理是，血凝素特异性地结合于作为细胞粘附分子的E-钙粘素(cadherin)而抑制细胞间粘附。本公开的基础是，本申请专利技术人进一步反复深入研究，结果发现血凝素具有有助于促进多能干细胞的增殖的效果。具体而言，据推测血凝素发挥缓和细胞间粘附那样的功能，使所培养的多能干细胞的集落或细胞团块内的细胞环境容易增殖，从而促进增殖。并且，据推测通过缓和细胞间粘附，所培养的多能干细胞的集落的细胞间粘附力均匀化，能够抑制“脱离未分化状态的细胞”的产生。但是，本公开可以不限定于这些机理而进行解释。[多能干细胞]本公开中，多能(pluripotent)干细胞在非限定的一个或多个实施方式中，是人多能干细胞。本公开中，人多能干细胞在非限定的一个或多个实施方式中，是人iPS细胞或人ES细胞。[脱离未分化状态的细胞]本公开中，脱离未分化状态的细胞(脱离未分化的细胞)在非限定的一个或多个实施方式中，是指细胞形态与未分化状态的细胞的形态不同，能够辨别。进一步，成为脱离未分化的细胞在非限定的一个或多个实施方式中，能够通过未分化标志物的消失而确认。未分化标志物在非限定的一个或多个实施方式中，是Oct3/4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60。[血凝素(HA)]本公开中，血凝素在非限定的一个或多个实施方式中，是肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)的血凝素。本公开中，血凝素在没有特别提及的情况中，是指神经毒素复合体(也称为血凝素复合体)。从促进具有多能性的细胞的增殖的观点出发，血凝素可以举出包含由选自肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的3种血凝素亚单位HA1(HA33)、HA2(HA17)和HA3(HA70)中的2种或3种成分构成的复合体或其复合体的血凝素。血凝素包含由HA2(HA17)和HA3(HA70)构成的复合体或由3种成分构成的复合体或其复合体。上述亚单位HA3(HA70)在一个或多个实施方式中，从促进具有多能性的细胞的增殖的观点出发，优选为A型或B型的肉毒梭状芽胞杆菌的亚单位。此外，亚单位HA1(HA33)和HA2(HA17)在非限定的一个或多个实施方式中，可以为A型、B型、和C型中任一肉毒梭状芽胞杆菌的亚单位。血凝素在非限定的一个或多个实施方式中，各亚单位各自可以为重组体，也可以为天然型。[血凝素的变体]本公开中，血凝素在具有有助于促进多能干细胞的增殖的效果的范围内，可以为血凝素的变体。作为该变体的一个或多个实施方式，可以举出亚单位中的1个、2个或3个氨基酸序列具有至少1个氨基酸突变。作为该变体，可以使用WO2015/199243所举出的物质。本公开中，在没有特别说明的情况下，“血凝素”包含“血凝素变体”。此外，本公开中，在没有特别说明的情况下，“血凝素变体”具有有助于促进多能干细胞的增殖的效果。[促进多能干细胞的增殖的组合物]本公开作为一个实施方式，涉及用于促进多能干细胞的增殖的组合物，其包含血凝素或其变体。从增殖具有多能性的细胞的促进的观点出发，本公开所涉及的促进增殖组合物优选包含有效量的血凝素或其变体。根据本公开所涉及的促进增殖组合物，能够促进多能干细胞的增殖。根据本公开所涉及的促进增殖组合物，在一个或多个实施方式中，进一步能够进行均匀性高的培养。在此，均匀性高是指可以包括例如所培养的细胞的细胞间粘附的均匀性高、细胞间粘附力的均匀性高、或者细胞团块的大小一致。均匀性高的培养能够有助于提高增殖后得到的多能干细胞的品质。本公开所涉及的促进增殖组合物在一个或多个实施方式中，与以往的培养方法不同，使细胞块或集落中的各细胞间的均匀性高的培养成为可能。其结果是，在以往的培养方法中增殖能力低的细胞变多的位置、例如在细胞块内部或集落的周边部以外的位置，维持细胞增殖能力的细胞的存在数也增加，其结果是也能够以高效率使细胞增殖。本公开所涉及的促进增殖组合物能够添加于多能干细胞的培养基中而使用。作为培养基中的添加浓度，在一个或多个实施方式中，从促进具有多能性的细胞的增殖的观点出发，可以举出使添加后的培养基中的血凝素或其变体的浓度达到5nM以上、10nM以上、或15nM以上的浓度。此外，从相同的观点出发，可以举出使其达到200nM以下、150nM以下、或100nM以下的浓度。作为本公开所涉及的促进增殖组合物的使用方法，可以举出后述的促进多能干细胞的增殖的方法、和多能干细胞的培养方法。[促进多能干细胞的增殖的方法]本公开作为一个实施方式中，涉及一种促进多能干细胞的增殖的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进增殖组合物，其用于促进多能干细胞的增殖，包含血凝素或其变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.20 JP 2016-2470641.一种促进增殖组合物，其用于促进多能干细胞的增殖，包含血凝素或其变体。2.一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括在添加了权利要求1所述的促进增殖组合物的培养基中培养多能干细胞。3.一种促进多能干细胞的增殖的方法，其包括：接种单一细胞状态或分散状态的多能干细胞，和在添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪之冈正博，金美海，藤永由佳子，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP